年产0.5亿支带状疱疹疫苗生产车间工艺设计

年产0.5亿支带状疱疹疫苗生产车间工艺设计目录TOC\o"1-2"\h\u16021摘要 39142前言 4198811生产工艺设计 5198361.1带状疱疹灭活疫苗的制备方法介绍 5307041.2带状疱疹灭活疫苗制备的工艺流程 5209911.3病毒收获液制备 6291831.4层析柱纯化及半成品配制 661861.5分包装及冻干 684712物料衡算 6108012.1物料衡算的条件生产制度：单班次生产年工作日：276天 683693设备选型 8203423.1工艺设备选型的依据 8300253.2制药设备材料的选择 9293443.3设备选型参数 9242154车间平面布置设计 1475354.1车间平面布置设计 1432334.2制剂车间工艺布局设计 14245844.3对人员和物料的要求 15220904.4空调及排风 15265784.5车间平面布局图 15177265药理作用 16271696不良反应 1610868结论 1626937参考文献 1618337致谢 19

摘要带状疱疹是一种常发生于老龄人群、免疫功能低下和慢性病人群皮肤上的一种簇集型水疱病，由潜伏在神经元内的水痘-带状疱疹病毒重新激活引发。带状疱疹的持续性疼痛使患者饱受痛苦，带来严重的精神负担和经济负担。在临床药物治疗效果不佳的情况下，国外先后有减毒活疫苗和伴佐剂的重组蛋白疫苗上市，根据这两款疫苗的临床数据分析，后者已经成为美国疾病控制和预防中心推荐的首选疫苗，国内多家企业也在开展这两种疫苗的临床研究。然而，由于佐剂来源的限制，重组蛋白疫苗尚未广泛提供。随着新型冠状病毒肺炎疫情的出现，mRNA疫苗的热度也被提升，国内生物制品企业应根据国内的市场需求并结合自身发展，积极开展新型带状疱疹疫苗的研制，填补国内疫苗的空缺，增强市场竞争力。在满足《药品生产质量管理规范》（2012年修订）和《中国药典》（2020年版）的前提下，本文从生产工艺流程、车间布置、生产物料衡算等几个角度出发，通过实例，对其生产工艺进行了归纳和分析。以生产高水准、现代化的生产工艺为技术参考。最终设计出可顺利安全地完成年产量要求、并且产品有效安全的带状疱疹灭活疫苗生产车间。关键词：带状疱疹灭活疫苗；车间设计；工艺流程；物料衡算

AbstractHerpeszosterisaclusterofvesiculardiseasethatoftenoccursontheskinofelderly,immunocompromisedandchronicpeople,triggeredbythereactivationofvaricella-zosterviruslatentinneurons.Thepersistentpainofherpeszosterhurtspatients,bringingseriousmentalburdenandfinancialburden.Inthecaseofpoorclinicaldrugtreatmenteffect,foreignhasliveattenuatedvaccineandadjuvantrecombinantproteinvaccine,accordingtotheclinicaldataanalysisofthetwovaccines,thelatterhasbecomethecenterfordiseasecontrolandpreventionrecommendedpreferredvaccine,manydomesticcompaniesarealsointheclinicalresearchofthetwovaccines.However,recombinantproteinvaccinesarenotwidelyavailableduetoadjuvantlimitations.WiththeemergenceofCOVID-19,thepopularityofmRNAvaccinehasalsobeenincreased.Domesticbiologicalproductsenterprisesshouldactivelycarryoutthedevelopmentofnewherpeszostervaccineaccordingtothedomesticmarketdemandandtheirowndevelopment,soastofillthegapofdomesticvaccineandenhancethemarketcompetitiveness.OnthepremiseofmeetingtheGoodManufacturingPractice(revisedin2012)andChinesePharmacopoeia(2020edition),thispapersummarizesandanalyzestheproductionprocessfromtheperspectivesofproductionprocess,workshoplayoutandproductionmaterialbalance.Theproductionofhighlevel,modernproductionprocessasatechnicalreference.Finally,thedesignedherpeszosterinactivatedvaccineproductionworkshopcansuccessfullyandsafelycompletetheannualoutputrequirements,andtheproductiseffectiveandsafe.Keywords:herpeszosterinactivatedvaccine;workshopdesign;processflow;materialbalance

前言带状疱疹是水痘－带状疱疹病毒再激活的临床表现，常出现在某一感觉神经节支配的身体一侧的皮区处，皮损不会超过身体中线，是一种呈带状分布的簇集型水疱病。ＶＺＶ具有双链ＤＮＡ基因组，核衣壳的包膜表面覆盖着多种糖蛋白，在病毒侵染细胞过程中起着重要作用。ＶＺＶ病理学的一个标志是在皮损中形成多核细胞，这种多核细胞是由ＶＺＶ糖蛋白ｇＢ、ｇＨ和ｇＬ介导的细胞间融合构成的［1］。其中，糖蛋白Ｅ是ＶＺＶ表达最丰富的一种糖蛋白，并且具有高度的免疫原性，在病毒感染细胞以及病毒在细胞间的扩散中发挥重要作用［2］。ＶＺＶ具有高度传染性，一项挪威的单项研究［3］显示，ＶＺＶ在儿童中的传播系数（易感染人群中因一个病例直接产生的预期病例数）在３．７～５，而疫苗覆盖率至少要达到７３％～８０％才能有效地阻断传播。与年龄相关的免疫力／免疫抑制下降可重新激活ＶＺＶ，导致带状疱疹。研究表明，Ｔ细胞免疫应答频率下降与ＶＺＶ再激活的发生率增加相关［4］。病毒一旦激活就会大量复制，通过感觉神经轴突移行到皮肤，引起带状疱疹及相关并发症。最常见的并发症是带状疱疹后神经痛，在60岁或以上的带状疱疹患者中发生率为１０％～２０％。由于一旦出现带状疱疹就无法预防ＰＨＮ，这种持续性疼痛对生活质量和日常生活活动有显著的不利影响。而疼痛主要是由激活的ＶＺＶ对感觉神经节神经元胞体和神经节内的卫星细胞以及神经元轴突造成损害引起的，这种情况难以用止痛药治疗［5］。由于带状疱疹的出现与体内ＶＺＶ特异性ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞活性降低有关，带状疱疹疫苗的主要作用是预防和控制ＶＺＶ感染和再激活。对无菌的要求严苛是疫苗生产的特点，应严格控制管理、生产，进而降低污染的风险，以确保疫苗无菌状态[6,7]。在药品生产的全过程做到严格监控，可能产生的污染因素应做到被严格有效清除。生产车间、生产设施和生产设施的设计、生产布局的特点都有很大的差异。在药品的无菌化生产工艺中，原辅材料、人员与药品的相互影响是必须要重点考虑的。其车间的布置应以最小化错误风险为目标。原辅材料尽量最短路径运输，以避免来回交叉、减少错误和污染[8]。为了使生产区域的环境达到生产要求,常对生产厂房设施、生产工作人员、生产设备、生产用物料进行严格消毒[9]。将疫苗生产场地的洁净度分为A级、局部A级、B级、C级和D级。使用带状疱疹病毒森“张”株对原代地鼠肾细胞进行接种，期间经病毒培养、灭活、收获、离心、超滤浓缩、层析纯化后，加入氢氧化铝佐剂和人血白蛋白等相应剂制成带状疱疹灭活疫苗。它用来作为对带状疱疹疾病的预防药物[10]。1生产工艺设计1.1带状疱疹灭活疫苗的制备方法介绍目前国内外的带状疱疹灭活疫苗生产一般都采用转瓶及细胞工厂进行细胞培养和病毒培养。采用流加培养方式，使培养经过处理，细胞膜表面的吸附性得到了显著的增强，相对于细胞工厂工艺技术及转瓶培养技术来说，可以缩小培养区域空间、节约运行时间;并且生物反应器可实现细胞培养的自动化操作,从而显著地降低投资成本和工作强度[11-14]。疫苗生产的工艺过程可以分成三个阶段：制备病毒收获液、纯化和冻干。其中，制备病毒收获液阶段又分为培养细胞阶段（细胞复苏、扩增培养至生物反应器）和培养病毒阶段（培养病毒、病毒的接种、病毒液收加）[15]。纯化阶段包括连续流离心、超滤浓缩、柱层析、半成品配制。1.2带状疱疹灭活疫苗制备的工艺流程图1-1带状疱疹疫苗制备的工艺流程图1.3病毒收获液制备取工作种子进行扩增培养，按照1：4-1：6传代比例进行传代，逐步向生物反应器中进行扩建培养。从25cm2的细胞培养瓶逐级放大至125cm2的细胞培养瓶、250cm2的细胞培养瓶、细胞工厂、生物反应器进行培育。含有刚出生牛血清的细胞培养液是培育Vero细胞时所使用的，PH为7.0-7.4，培养的温度控制在在36-38℃。待生物反应器内细胞生长至对数生长期时，按照一定比例的MOI进行感染。培养4天后开始进行流加收获。流加速度为20-30L/d，可连续收加10-15天。病毒培养液的PH为7.4-7.8。检验通过以后，将浓度为0.95%-1.25%的甲醛溶液加入到原溶液中，37℃灭菌时间至多7天。灭活后，低温处于不低于2℃不超过8℃保存。1.4层析柱纯化及半成品配制将病毒收获液在离心过程中连续导入，使沉淀留在离心仓中，不断排出上清液。病毒收获液经过连续流离心后，再进行50倍超滤浓缩。灭活后的浓缩收获液再通过层析纯化，流加速度应为20-40cm/h，温度控制在18-26℃，上样量占层析胶体的5％-7％。除菌是层析后的重要环节，除菌后所得即为原液。将原液按照1：16进行稀释后用适宜人血白蛋白、适量的氢氧化铝佐剂和硫柳汞抑菌剂进行1：1配制成半成品形式。1.5分包装及冻干半成品进行相关检测，检测项目包含病毒滴定、无菌检查、支原体检查、游离甲醛含量、硫柳汞含量、衣原体检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查、抗原含量、蛋白质含量、效价测定。检测合格后方可进行分批操作，成品必须按照生物制品的分批规程进行分批，将分批好的疫苗进行分装进盒，分装后的产品放入冷冻干燥机中进行冻干操作。再采用灌封技术，将西林瓶-灌装-封口联动线生成装有疫苗的试剂，需符合生物制品分装规程的规定。2物料衡算2.1物料衡算的条件生产制度：单班次生产年工作日：276天年处理量：0.5亿支产品包装：0.5ml西林瓶，每支含抗原48μg/ml批产量时间：69天/批物料所需：500×104支×0.5ml/支=250×104ml考虑10％的物料损失：(250-250÷10％)×104＝278×104ml原液在半成品配制前需按照1：16进行稀释，原液和佐剂在配制的过程中比例约为1：1，考虑到10％的物料损耗，所以配制前的原液的量为：[（278÷2÷16）÷（1-10%）]×104≈9.6×104ml考虑到层析10％的损耗，可得出层析前的液量为：(9.6-9.6÷10％)×104≈10.7×104ml考虑到50倍超滤和10％的损耗，超滤前液量为:[10.7-10.7÷10％]×50×104＝595×104ml考虑到连续流离心10％的损耗，病毒收获液的总量为：[595-595÷10％]×104=662×104ml＝6620L所以所需批次为6620÷1800≈4批表2-1每批所需时间操作名称 所需时间生物反应器预处理 7天病毒培养 4天病毒液收加 15天离心 2天超滤 2天层析 2天各项检验 30天细胞培养 7天每批次用时 69天根据5%损耗计算西林瓶年用量，即生产量为550万，考虑外包装损耗量小，所以按照5%损耗进行计算图2-1分包装流程消耗图包装盒：5×106盒/年÷0.95=5.26×106盒/年说明书：5×106张/年÷0.95=5.26×106张/年标签：5×106张/年÷0.95=5.26×106张/年纸箱：5×106瓶/年÷200瓶/箱=2.5×104箱/年西林瓶：5×106瓶/年÷0.95＝5.26×106瓶/年3设备选型生产工艺装备的选择，既要做到技术成产业化，又要严格确保产品的品质符合有关规定规范，还要考虑采购成本合理。3.1工艺设备选型的依据A.选择满足《药品生产质量管理规范》的可靠的生产设备；B.根据生产量的大小实现最大的产出；C.为了适应产品的需要，操作过程轻便迅速，易于维护和清洁。3.2制药设备材料的选择在药品生产中，药品的生产设备必须确保原料、辅料、包装材料等不会受到任何的影响，如果所使用的仪器与药品是直接接触的，则要确保仪器的外观光亮、平整、具有防腐蚀、误差小、便于清洗、灭菌和杀菌的特性。3.3设备选型参数（1）连续流离心机（型号OPTIMAL-80XP)处理量：100L/H离心力：12595xg每批可得出1800L，每天工作时间8H，离心2D，故建议采用连续流离心机2台3-1连续流离心机（OPTIMAL-80XP)（2）层析柱外径：900mm柱长度：6000mm收集瓶：2000L每批可得出原液为1800L,上样量占层析胶体的5％-7％故建议层析柱为2台3-2CSZ57层析柱（3）西林瓶加塞机生产能力：500瓶/分重量：600kg外形尺寸：2000×1300×1650电压：220V/50HZ工作时间：10H每小时可生产500×60＝30000万每批次需要西林瓶5.26×106÷4＝1.315×106个故建议该设备1.315×106÷30000×10≈5台3-3FN2020西林瓶加塞机（4）40L生物反应器一台40L篮式生物反应器每次可收获30L,每批可收获15次，一台生物反应器每批可产出15×30＝450L使用4个40L篮式生物反应器作为一批次原料，理论上每批次可获得15×30×4=1800L考虑生产成本等因素使用4个40L篮式生物反应器作为一批次原料。3-740L生物反应器（5）不锈钢配液搅拌罐容积:500L每批次每天病毒培养液量约为120L，根据生产批次的投入量，选择病毒用于配制培养液的搅拌罐需要2个，配制缓冲液搅拌罐需要2个，配制NaOH溶液需要1台。故建议该设备5台3-5DBS01型不锈钢配液搅拌罐（6）洗瓶设备速度：350瓶/分水压：0.1-0.5Mpa超声波功率：0.8Kw电源：220V50HZ主电机功率：0.6Kw适用范围：0.5-500ml工作时间10小时，一台10H可洗出10×350×60＝2.1×105个根据疫苗每批产量和成本等因素考虑，选择2台该设备即可满足生产要求。故建议采用该洗瓶设备2台3-6KENY08型西林瓶清洗机（7）标签粘贴机生产能力：600瓶/分电压：220V/50HZ额定功率：1500W重量：200Kg工作时间：10H，一台一天可贴600×10×60＝3.6×105根据疫苗每批产量和成本等因素考虑，选择2台该设备即可满足生产要求。故建议采用SJ552-A型标签粘贴机2台3-7SJ552-A型标签粘贴机（8）柯百特中试超滤器规格：360L超滤膜：再生纤维素筛网：聚丙烯最大进液压力：4bar处理量：＞50L故建议采用该设备2台3-8柯白特中试超滤器表3-1所需设备序号设备名称设备型号设备台数/台1连续流离心机OPTIMAL-80XP22CSZ57层析柱CSZ5723西林瓶加塞机FN202054不锈钢配液搅拌罐DBS0155西林瓶清洗机KENY0826标签粘贴机SJ552-A27超滤器柯白特中试28生物反应器Xcelle44车间平面布置设计4.1车间平面布置设计制药厂的车间布置应满足工艺流程的要求，便于操作、安装和维护。做到工艺流程顺畅。将巨大的、启动时可以产生强烈声响和摇晃的设备应放置在车间的最下层，从而削弱车间的最大承载量剧烈晃动[20]。不影响开启门和窗户、不妨碍光线的进入和风的流通是重型设备沿着墙面布置时应该考虑的重要因素。在布置设备时，避免设备与建筑物及沟槽、坑道等发生磕碰、堆叠和拥挤[21]。对于可以产生强烈晃动的设备，其操作台和面板不可以与建筑的承重柱、墙和建筑基准相连接。在多楼层放置生产设备时，在各个楼层上预留小孔是首先考虑的，干扰或割断建筑物上柱、承重的结构布置是被禁止的。考虑到安全和防腐的要求，有防火防爆要求的设备必须按照防火防爆的规定进行布置。比较安全的做法是将爆炸风险的设备放置在单层厂房内。假如不得不放置在二层以上的厂房内，厂房的边缘和顶层是最优的选择，以便进行防爆处理。酸碱等腐蚀性介质的设备应布置在底层，以减少防腐处理范围，节省投资[22]有毒、易燃易爆气体或粉尘产生设备应考虑工厂通风或局部通风。不同生产过程的运行必须采取有效的隔断措施，不得相互干扰。在相同房间中，进行不相同的品种或者相同品种但是规格不一致的操作是禁止的。车间布局应考虑清污隔离、人员隔离、细菌和无菌操作区隔离等措施，尽量避免或减少人员和物料的往返和交叉[23]。4.1.1车间布局的总体要求（1）在进行设备规划时，要考虑综合的因素，使设备的布置受到各方面的影响，从而使其获得最优的性能。（2）产品在生产的过程中可以无阻碍流动，布局时应考虑到。进一步消除不必要的停顿，并可以轻松安全做到加快生产流速。（3）储物区和生产工作区域应有效地利用空间和空间布局。灵活性原则应考虑各种因素变化可能带来的不利后果。4.2制剂车间工艺布局设计（1）根据《药品生产质量管理规范》、生产工艺流程，设计出生产设计区域分布。在考虑共同生产或不一起生产时，将区域按照洁净度要求进行合规划分（2）不得采取有效措施隔离不同的生产过程。不得在同一房间内同时操作不同品种或同一品种的不同规格。车间布局应考虑净化隔离、人员隔离、无菌操作区隔离等措施，尽量避免或减少人员和物料的往返和交叉。（3）生产原料和生产人员的净化所用的房屋尺寸应适中，不应太大或者太小。净化所使用的程序、设备、清洁等级应该和生产要求匹配一致，人员入口和物料入口分开，生产原料运输线路应做到安全精简。生产原料必须仔细地进行清洁处理在进入清洁区域之前，无菌生产所需的物料必须经无菌处理后方可进入无菌操作区。4.3对人员和物料的要求员工在进入无尘室前必须先进行洗澡更换工作服，经吹淋消毒后方能入场工作；材料在被送入无尘室之前必须在缓冲区域内进行杀菌消毒[24]。4.4空调及排风空调的核心功能是保证室内的新鲜空气输入。车间内对空气品质必须严格管理，需对空气中的尘埃或者颗粒物进行处理。为可使微尘排出，应提供足够的空气进入量；并对各部门的入口进行单独的调节。4.5车间平面布局图图4-1车间平面布局图5药理作用本品提供一种带状疱疹病毒SZV株，病毒滴定度可以被稳定在一个合理的范围内。同时证明该株的能引起细胞正常机理发生改变的能力稳定，免疫反应性广，无外源性有害污染物污染。营养要求不高。可以使用标准培养基进行培养。培养条件比二倍体细胞，原代细胞更加容易。而且可用于生物反应器进行从而进行大规模生产。6不良反应疫苗中的药物溶液被吸收后，系统症状可能由免疫或非免疫因素引起。如发热(多为低热，体温一般不超过38.5℃)、头疼、头晕、恶心、呕吐、腹泻、乏力、肌肉酸痛、嗜睡、精神不振、食欲减退等，有时由于受种者精神过于紧张，还可能出现晕针现象，表现为面色苍白、头晕、心悸、胸闷、晕厥等症状。受种者除了可能出现以上常见不良反应外，还可能出现严重的过敏反应，快速过敏反应可在疫苗注射后几分钟至数十分钟内出现。结论本文针对年产量0.5亿，工作时间276天的带状疱疹灭活疫苗生产车间进行设计，工作5批次，每批次引用了4个40L生物反应器进行培养，可实现大规模生产带状疱疹灭活疫苗要求。生产采用流加灌培养，培养基经过特殊方法的处理后，显著的提高了细胞膜的吸附性，可以节约工作时间和培养车间的面积成本。整个过程从细胞传代开始经过细胞的培养、病毒的接种、病毒培养、连续收加、离心、超滤、层析、配制、冻干直到分包装，实现了产业化生产，可实现全程质量监控。确保了产品的质量与安全。设计中工艺流程符合《中华人民共和国药典》（2020版）中的相关规定。严格按照GMP标准进行设计。工作时间安排符合国家相关法律法规要求，科学合理，保证员工身心健康的同时，通过本设计，通过对相关文献的工艺流程分析以及改进，完成了年产0.5亿支带状疱疹灭活疫苗生产车间的生产车间平面布局图，生产设备选择，所需物料的衡算的设计。参考文献[1]张朔,赵建,孙宏亮等.带状疱疹灭活疫苗（地鼠肾细胞）细胞工厂培养工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,2021,34[2]RODRGUEZY，ＲOJASM，GEＲSHWINME，etal．Tick-bornediseasesandautoimmunity:acomprehensivereview［J］.JAutoim-mun，2017，88(3):21-42．[3]李文娟,张颖,张朔等.两种不同培养工艺制备带状疱疹灭活疫苗的免疫原性及安全性评价[J].中国生物制品学杂志,2020,33(03):246-249.[4]邱宇鹤，王轶文，何淑云．带状疱疹疫苗的研究进展［J］．中国生物制品学杂志，2015，28(11):1228-1230．[5]王倩莹，李樊，付士红，等．2014年中国蜱传脑炎流行病学特征［J］．中华实验和临床病毒学杂志，2018，32(6):602-606．[6]国家卫生计生委，国家中医药管理局，总后卫生部.抗菌药物临床应用指导原则（2015版）［S］.北京:人民卫生出版社，2015：14.[7]梅可佳,刘岩松,张颖等.生物反应器制备带状疱疹灭活疫苗(Vero细胞)的免疫原性及安全性评价[J].中国生物制品学杂志,2020,33(10):1089-1092.[8]PANASIUKB，PＲOKOPOWICZD，PANASIUKA．Immunologi-calresponseinHIV-positivepatientsvaccinatedagainsttick-borneencephalitis［J］.Infection，2020，31(1):45-46．[9]JELINEKT．TBE-updateonvaccinationrecommendationsforchil-dren，adolescents，andadults［J］．WienMedWochenschr，2019，162(11/12):248-251．[10]DEMICHELIV，DEBALINIMG，ＲIVETTIA．Vaccinesforpre-ventingtick-borneencephalitis［J］.CochraneDatabaseSystＲev，2019，21(1):CD000977．[11]CHＲDLEA，CHMELIKV，ＲUZEKD．Tick-borneencephalitis:whattravellersshouldknowwhenvisitinganendemiccountry［J］.HumVaccinImmunoth，2018，12(10):2694-2699．[12]ASKLINGHH，VENES，ＲOMBOL，etal．ImmunogenicityofdelayedTBE-vaccinebooster［J］．Vaccine，2019，30(3):499-502．[13]SCHONDOＲFI，SCHONFELDC，NICOLAYU，etal．Respons