SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤

实验十五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1精选2021版课件一、概述蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS,SDS将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键打开，使蛋白质变性，SDS将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情况下，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量，即蛋白质分子的大小。因此利用SDS可测定蛋白质的分子量。2精选2021版课件二、试剂丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis)称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存于棕色瓶中，于4℃保存。4X分离胶缓冲液称取Tris18．17g，加入10%SDS贮备液4ml，用12mol/LHCl调pH至8，8，定容至100ml。4X浓缩胶缓冲液称取Tris6.06g，加入10%SDS4ml，用l2mol/LHCI调pH至6．8，定容至100ml。10%过硫酸铵称取过硫酸铵0.5g，加水至5ml。本储存液应现配现用。10X电极缓冲液称取Tris30g、甘氨酸144g，加入10%SDSl00ml，定容至1000ml。2X样品缓冲液称取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10%SDS2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、β-巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。染色液称取考马斯亮蓝R-2502.5g，加入甲醇450ml，冰乙酸l00ml、水650ml。脱色液甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水800m1.3精选2021版课件三、操作步骤1、分离胶的制备(1).根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度，制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表，该配方可配制0.75mm厚、10cmX7cm的凝胶。在配制凝胶时，将水、30％Acr和Bis储液、4X分离胶储液混合完全后，真空脱气5分钟，然后加入过硫酸胺和TEMED，立即准备灌制凝胶。(2).将混合液充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作过程中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。(3).置于室温下15-30分钟，使凝胶聚合完全(在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8,0.1%SDS)洗凝胶表面，准备灌制浓缩胶。4精选2021版课件不同浓度凝胶的制备成份不同浓度所需的储备液体积8.5%10%12.5％15％17.5%H2030%Acr和Bis分离胶4X缓冲液10%过硫酸铵TEMED3.5ml2.0mll.9ml112u15ul3.1ml2.4ml1.9ml112ul5ul2.5ml3.Oml1.9ml112ul5ul1.8ml3.7ml1.9ml112ul5ul1.2ml4.3ml1.9ml112ul5ul5精选2021版课件2.浓缩胶制备的方法(1).将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后，立即灌胶。(2).将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中，然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完全后即可拔去梳子，准备电泳。6精选2021版课件3.样品制备及电泳(1).样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使用。(2).上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验的需要加样电泳。(3).电泳：通常使用稳流的方式进行电泳，电流一般为18mA，时间大约3-4小时。7精选2021版课件4、凝胶的染色与脱色电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。小心地取出凝胶，置于染色液中染色4小时，并不时地轻轻晃动。染色完毕后，倒去染色液，用少量水淋洗凝胶，然后置于脱色液中脱色，并轻轻晃动，脱色至蓝色背景消失为止。此凝胶