非洲猪瘟病毒抗体检测阻断酶联免疫吸附法

1非洲猪瘟病毒抗体检测阻断酶联免疫吸附法本标准规定了检测非洲猪瘟抗体的阻断酶联免疫吸附试验方法及其试剂制备GB/T6682分析实验室用水规格和SN/T2123出入境动物检疫实验样品采ASF：非洲猪瘟。ASFV：非洲猪瘟病毒。bELISA：阻断酶联免疫吸附试验。2a)主要菌株与质粒:pET-52b(+)3C/LIC-p54重组表达质粒（含ASFVp54目的基因，片段大小为552bp）；感受态细胞BL21(b)主要试剂:LB培养基；PCR反应母液；琼脂糖凝胶；IPTG；氨苄青霉素；细菌细胞蛋液；终止液。具体配制方法见附录A。非洲猪瘟标准阴性血清）；3采用引物对（上游引物序列为5’-ATGGATTCTGAATTTTTTCA-3’，下游引物序列为增出552bp的特异性条带，具体核苷酸序列可参考7.3ASFVp54蛋白抗原的表达、将含pET-52b(+)3C/LIC-p54重组表达质粒载体的BL21(DE3)宿主细胞，在含100mg/L7.3.2.1将7.3.1中收集的菌液在4℃3007.3.3.2浓度测定复溶后蛋白质浓度应不低7.3.3.3纯度测定采用SDS对表达产物进行考马斯亮蓝染色，结果只在28ku大小处结果应在28ku大小处出现诱导表达条带。采用非洲猪瘟标准阳性血清对表达产物进行免疫7.3.3.5贮藏与有效期置2～8℃贮藏，有效期为4采用商业辣根过氧化物酶标记试剂盒对单克隆抗体进行酶标记，分装冷冻8.3.2.2浓度测定蛋白含量应不低于1.0mg/m8.3.2.3效价测定用7中制备的p54蛋白抗原（2.5µg/mL包被ELISA板进行间接ELISA9.1.1非洲猪瘟标准阳性血清来源9.1.2非洲猪瘟阳性血清的检验及贮藏9.1.2.3效价检验用ASF国际参考ELISA试剂盒试验，PI值大于80%。59.2.1非洲猪瘟阴性对照血清来源9.2.2非洲猪瘟阴性血清的检验及贮藏9.2.2.3效价检验国际参考试剂盒试验检测PI值小于40。9.3待检血清样品的准备样品保存等操作可按《出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范》（9.4阻断ELISA试验操作9.4.1包被9.4.2洗板9.4.3封闭9.4.4洗板9.4.5加样9.4.6洗板），69.4.9洗板9.4.10加底物液9.4.11加终止液9.4.12结果读取当标准阳性血清PI值≥80%，而标准阴性血清OD值≥1.0时，试验成立。则待检样品可7A.30.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PNaHCO3Na2CO3水2CO3.10H2OA.5洗涤液（0.01mol/LpH7.4PBS0.05%Tween-20，PBST）8NaClNa2HPO4.12H2O水A.7底物液）：水）：水9水1atggattctgaattttttcaaccggt61gtcaccccaccaagcttcttctcca121ttagtcattattatcatc181gccgctattgaggaggaagatatacagt241gaagtcactccacaaccaggtacctctaaaccggctgga301aaaccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccagcaa361aacccagttacggacagactagtcatggcaactggcgggc421gcgagtgct