补体结合反应检测技术

知识目标技能目标素质目标1.重点掌握补体总活性测定、补体结合试验、补体测定的应用。2.熟悉补体的性质与激活途径、3.了解单个补体成分的测定、溶血素的效价滴定1、会熟练操作补体活性测定、补体结合试验2、会解释结果及临床分析通过学生相互鼓励、严谨、认真操作，各小组共同协作将任务完成，培养了与人合作、与人沟通的能力

任务目标补体溶血试验补体C3活性测定任务对象

任务过程

复习提问

案例导入

讲解与示教学生操作讨论分析

评价、考核

课后思考题教学环节2′30′2′10′40′5′1′患者，女，33岁，因反复感染入院。入院后查体：T38℃，P115次／min，发育正常，神志清楚，经检测抗体含量正常，细胞功能正常，已初步诊断为某种成分缺乏引起以下病症，请问该病人还需做什么检测？案例导入试验演示补体溶血试验演示操作:致敏SRBC制备去C4血清制备全溶血标准管各试管参加缓冲液混匀，观察结果分组：分为6个小组，分别设立组长、副组长观察结果：根据出现结果进行判定

学生操作讨论分析提出问题什么是补体，为什么会导致血细胞溶解展开讨论

十九世纪末,在发现体液免疫后不久,Bordet即证明,新鲜血清中存在一种不耐热的成分,可辅助特异性抗体介导的溶菌作用。由于这种成分是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件,故被称为补体(complement，C)

补体并非单一分子,而是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活化后具有酶活性的蛋白质,包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故被称为补体系统。讨论分析讨论分析补体

性

质讨论分析1.所有补体成分均为糖蛋白2.补体在血清中含量稳定3.补体大多属于β球蛋白4.补体性质很不稳定补体的固有成分：补体激活级联反响的补体成分经典途径MBL途径旁路途径末端成分C1q、C1r、C1s、C4、C2、C3MBL、丝氨酸蛋白酶B因子、D因子C5、C6、C7、C8、C9补体调节蛋白：包括备解素、I因子、C1抑制物等补体受体：包括CR1~CR5、C3aR等讨论分析原理补体经典途径的激活物---Ag-Ab复合物补体无特异性待测Ag或Ab(?)+相应Ab或Ag(

)补体(

)SRBCs(

)反响系统补体系统指示系统讨论分析(?)反响系统补体系统指示系统讨论分析

1.激活物及激活条件AbAg免疫复合物〔IC〕〔IgM、IgG1、2、3〕构象改变暴露补体结合部位2个以上补体结合位点C1q球型头部结合C1q1r1sC1q1r1sC1q1r1sC1q1r1s补体.ppt补体的激活讨论分析Ag与Ab比例需预先滴定---方阵法补体亦需预先滴定Ag〔用于检测Ab〕---纯血清标本---及时别离与检测；或-20°C保存；56°C30min处理正式试验---定性；半定量〔以50%溶血为标准〕讨论分析讨论分析讨论分析试验方法〔一〕试剂的制备抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。抗原和抗体的滴定补体的滴定〔二〕血清标本试验前需灭活补体〔三〕正式试验见P185表19-10讨论分析AgAbAb对照

1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:44444443201:84444432101:164444332

01:32444432

001:644444210001:1284210000001:2563100000001:512000000000Ag对照000000001、2、3、4分别表示Ag-Ab反响强度；0表示100%溶血选择Ag与Ab均呈强阳性反响〔100%不溶血〕的最高稀释度作为其效价，为1个单位，正式试验中，一般用Ag2~4单位；Ab4单位Ag和Ab效价的方阵滴定管号1234561：60补体(ml)0.040.060.080.100.120.14缓冲液(ml)0.260.240.220.200.180.16Ag(2U/ml)0.10.10.10.10.10.137°C水浴min1%SRBCs(ml)0.20.20.20.20.20.237°C水浴min结果不溶血不溶血微溶血微溶血全溶血全溶血补体的滴定以能产生完全溶血的最少量补体为1单位；正式试验时使用2单位血清标本:采集血液标本后及时别离血清，及时检验或将血清保存于-20℃。血清在试验前应先加热56℃30min〔或60℃3min〕以破坏补体和除去一些非特异因素。正式试验:逐步参加各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶，1U为全溶或略带有少许红细胞，0.5U应不溶。受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。讨论分析补体结合试验操作程序────────────────────────────────────反响物待检血清管阳性阴性抗原补体对照管红细胞─────对照管对照管对照管───────对照管(ml)测定对照2U1U0.5U────────────────────────────────────稀释血清0.10.10.10.1-----抗原或抗体0.1-0.10.10.10.10.10.1-缓冲液-0.1--0.10.10.10.10.42U补体0.20.20.20.20.20.2---1U补体------0.2--0.5U补体-------0.2-────────────────────────────────────混匀，置37℃1h或4℃16～18h────────────────────────────────────致敏红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.2─溶-/不+溶血溶血溶血溶血全溶微溶不溶不溶────────────────────────────────────混匀，置37℃30min后观察结果─────────────────────────────────────────讨论分析优点：敏感性高---0.05g/ml的Ab特异性强---事先滴定；比例适当；无交叉反响结果明显---溶血与不溶血；与50%溶血比较无须特殊仪器---容易推广普及应用面广---传染病诊断；肿瘤Ag、自身Ag检测缺点：参与成分多，操作繁琐---很容易出错补体性质不稳定---难以标准化抗补体作用讨论分析考核评分表布置作业1.实验报告评价、考核思考题本实验过程复杂，有指示系统、反响系统、补体系统这些系统各起到什么作用？去掉指示系统是否可以？任务任务5-2C3测定

患者xx,男性,66岁,廉江县某单位干部。曾因肺部抗感染治疗半个月恢复,近来腹痛加重，服用抗生素没有明显效果,且经常出现感染，1998年12月5日步行入院,住院号7187。该病人已测抗体，正常，其他检查正常，请问还需做什么检查？案例导入C3测定演示操作:制板打孔参加抗C3抗体参加待测抗原置37℃24小时观察结果分组：分为6个小组，分别设立组长、副组长观察结果：根据现象判定结果查找缺乏进行修正

学生操作讨论分析提出问题展开讨论

免疫复合物可以激活补体，补体还能如何被激活？补体还有别的作用吗？讨论分析激活起始于炎症期产生的蛋白与病原体结合之后，其中参与补体激活的有甘露聚糖结合凝集素〔MBL〕和C反响蛋白。MBL是一种钙依赖性糖结合蛋白，属于凝集素家族，可与甘露糖残基结合。MBL首先与细菌的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合，形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶〔MASP〕。MASP具有与活化的C1q同样的生物学活性。C反响蛋白也可与C1q结合并使之激活，然后依次激活补体其他成分。补体激活的MBL途径讨论分析*

不经C1、C4、C2途径,而由C3、B因子、D因子参与的激活过程*

某些细菌、革兰氏阴性菌的内毒素、酵母多糖、葡聚糖、凝聚的IgA和IgG4以及其他哺乳动物细胞，均可不通过C1q的活化，而直接"激活"旁路途径。*

这种激活方式可不依赖于特异性抗体的形成。*C3是启动旁路途径并参与其后级联反响的关键分子。*

旁路途径的激活与调节具有以下两个重要的特点：1.旁路途径可以识别自己与非己2.旁路途径是补体系统重要的放大机制补体活化的旁路途径讨论分析讨论分析补体系统三条激活途径的不同点比较工程经典途径MBL途径旁路途径

Ag与Ab(IgM、IgG3、IgG1、gG2)形成的复合物参与的补体成分C1--C9炎症期产生的蛋白与病原体结合之后细菌脂多糖凝聚的IgG4IgA等

激活物质C2、C4、C5-C9、MBL、C反响蛋白C3、

C5-C9、B、D、P因子所需离子Ca2+、Mg2+Mg2+Mg2+C3转化酶C5转化酶作用参与特异性体液免疫的效应阶段参与非特异性免疫，在感染早期即发挥作用C4b2bC4b2bC3bBbC4b2b3bC4b2b3bC3bBb3b补体活化的调控一、补体的自身调控二、补体调节因子的作用1.C1抑制分子(C1INH)2.抑制经典途径C3转化酶形成〔一〕、经典途径的调节C4结合蛋白与补体受体1I因子

膜辅助蛋白衰变加速因子〔二〕、旁路途径的调节1.抑制旁路途径C3转化酶的组装H因子,CR1和DAF2.抑制旁路途径C3转化酶的形成I因子，CR1和MCP3.促进已形成的C3转化酶解离CR1和DAF4.对旁路途径的