层析分离法应国清老师课件

第十章层析技术

〔Chromatography〕一、概述定义——也称色谱层析、色谱、色层；样品中各组成依据其在固定相与流动相之间作用行为的差异进行屡次别离的过程。特点——别离精度高、适用范围广、设备简单、操作方便；处理量小、间歇操作等开展史——1903年一位俄国植物学家首次提出。1931年首次应用于制备；1938年适用范围扩展至无色物质；……二、层析法分类别离机理吸附层析——物质吸附力差异分配层析——物质分配系数差异凝胶层析——物质分子量差异吸附层析的种类物理吸附层析离子交换层析亲和层析疏水作用层析金属螯合层析有机染料层析凝胶层析别离原理固定相的形状柱层析纸层析薄板层析流动相的物态气相层析液相层析流动相压力低压中压高压三、层析技术的原理和术语平衡关系——分布系数CsKd=———CmCs：溶质在固定相中的溶度Cm：溶质在流动相中的溶度溶质在固定相中的量K’(容量因子)=————————溶质在固定相中的量K’=βKd〔β为相比〕阻滞因数〔Rf值〕溶质的移动速度Am〔流动相的平均截面积〕Rf=—————————=—————流动相在色谱系统中的移动速度Am+Kd·As〔固定相的平均截面积〕保存值——保存时间tR、保存体积vR

柱高〔L〕t0〔死时间〕=————tR=t0〔1+k’〕线速度〔ν〕别离度tR2—tR1R=————W1+W25、塔板理论——塔板数、塔板高度塔板数

tR

N=5.54{————}2

Wh/2塔板高度

LH=———N四、柱层析系统

工艺流程图层析柱—径高比〔10：1—1：100〕、材质〔玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等〕、耐压〔0.05－10MPa〕等泵—恒速、压力〔蠕动泵、柱塞泵等〕馏分收集仪—手动、自动检测仪通用型—示差折光、介电常数、电导等专用型—紫外、荧光、放射性检测器等记录仪工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理、自动打印出一套完整的色谱分析数据……实验室用的层析柱工业用的层析柱自动馏分收集仪〔国产〕自动馏分收集仪〔进口〕蠕动泵国产柱层析系统伯乐公司〔BIO-RAD〕柱层析系统发玛西亚公司〔Pharmacia〕柱层析系统五、亲和层析(AffinityChromatography,AC)

定义——利用生物大分子与其相应互补体间特异识别能力进行屡次差异别离的过程特点——选择性高、操作条件温和；亲和层析剂制备复杂，种类少3、常用的生物亲和关系

酶——底物及其类似物、抑制剂、辅助因子抗体——抗原〔蛋白、病毒、细胞〕激素——受体蛋白、载体蛋白外源凝激素——糖蛋白、多糖、细胞外表受体蛋白核酸——互补碱基段、核酸聚合酶、核结合蛋白4、亲和层析剂的制备载体〔骨架〕的选择载体的要求载体骨架高度亲水、惰性具有大量可供活化的化学基团具有较大孔径的网状结构良好的化学、物理、生物稳定性常用的载体多糖类〔葡聚糖、琼脂糖、纤维素等〕有机聚合物〔聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等〕混合类〔改性硅胶、多糖+树脂等〕载体〔骨架〕活化剂配基2〕配基的选择专一性配基——参照生物亲和关系类别性配基——酶的辅酶〔NAD+、NANP+、ATP等〕、外源凝激素〔伴刀豆球蛋白A等〕3〕配基与载体的结合载体的活化溴化氰法重氮化法环氧氯丙烷法高碘酸法共价偶联反响溴化氰法重氮化法高碘酸法环氧氯丙烷法4)亲和层析剂中“手臂〞“手臂〞的由来“手臂〞的种类亲水性〔肽链〕疏水性〔碳链〕“手臂〞的结合方法类似于配基的共价偶联反响5、亲和层析别离过程6、影响因素

离子强度亲和力为静电力为主：离子强度↑，↓亲和力为疏水力为主：离子强度↑，↑抑制氢键形成的物质pH值温度六、免疫层析定义——利用抗原—抗体特异性识别能力进行差异别离的过程。抗体〔配基〕的制备多克隆抗体——动物〔小白兔、山羊等〕整体免疫单克隆抗体——杂交瘤技术免疫层析剂制备—类似于亲和层析剂的制备杂交瘤技术原理B-淋巴细胞+→杂交瘤细胞→单克隆抗体骨髓瘤细胞操作过程B-淋巴细胞、骨髓瘤细胞融合杂交瘤细胞的规模培养单克隆抗体的别离纯化4.免疫层析应用生物药物〔蛋白类药物——酶类、多肽类〕别离纯化药物制剂〔靶向药物〕临床诊断〔免疫诊断试剂盒〕七、疏水作用层析

(HydrophobicInteractionChromatography，HIC)定义——利用生物大分子疏水作用力进行屡次差异别离的过程。疏水作用层析剂及其制备功能基团——苯基、醚基、短链烷基制备方法——类似亲和层析剂的制备方法3、疏水作用层析的影响因素

离子强度及种类破坏水化作用的物质外表活性剂温度4、特点

可直接别离盐析后的蛋白质可通过调节疏水配基链长和密度改变吸附力疏水性吸附剂种类多，选择余地大。八.有机染料亲和层析定义——利用某些类似于NAD+结构的有机染料〔蒽醌及偶氮化合物〕作为配基制成亲和层析剂进行差异别离过程。特点——结合容量大；配基价廉、易得；层析剂制