功能性精神疾病课件

功能性脑病的

疾病基因组学1精神疾病是指在各种生物学、心理学以及社会环境因素影响下，大脑功能失调，导致认知、情感、意志和行为等精神活动出现不同程度障碍为临床表现的疾病。精神活动包括：认识活动(由感觉、知觉、注意、记忆和思维等组成)、情感活动及意志活动这些活动过程相互联系，紧密协调，维持着精神活动的统一完整。精神疾病2传统概念：器质性精神疾病:

指由于脑部感染、变性、血管病、外伤、肿瘤等病变引起的精神疾病功能性精神疾病:“无确切病因和病理形态学变化”的精神疾病功能性精神疾病3精神分裂症(Schizophrenia)情感性精神障碍(AffectivedisordersorMooddisorders)儿童孤独症(Autism)儿童多动症等精神科常见的疾病功能性精神疾病4JohnForbesNash——著名数学家；1994年诺贝尔经济学奖得主；博弈论创始人之一凡高和他的向日葵56精神分裂症、双向情感障碍、儿童孤独症等众多精神疾病都具有遗传性，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。7Gottesman等对1921年到1987年在欧洲人中的研究综合分析后认为：精神分裂症同卵双生子的同病一致率为48%，二卵双生子的同病一致率为17%，普通人群中仅1%。Cardno等综述了1995年以来欧洲和日本的5个研究报告发现：精神分裂症患者的单卵双生同胞的同病一致率为41-65%，而二卵双生同胞的同病一致率为0-28%8160人中1人有ASD,1/500有自闭症(Chakravarti,JAMA2001)如有一子女患自闭症,下一个子女4.5%可能同患自闭症(比正常人群高22.5倍)同卵双生一子患病,60%可能另一子也会发病(比正常人群高300倍)另一同卵双生子超过90%可能性会有明显的社会能力障碍(socialimpairment)910

发现精神分裂症、孤独症等功能性精神疾病的易感基因并研究其功能,阐明疾病的分子基础，将为该类疾病的早期预警、早期预防、早期治疗、少复发、低致残，以及个体化医疗防治新策略提供临床理论基础。11一、疾病基因组学的内含

12人类疾病分类染色体病：染色体数目或结构异常所致的疾病称为染色体病。单基因病：由于单个基因的突变而引起的遗传病。由于单基因病的发生基本上受一对等位基因控制，故又称孟德尔遗传病。多基因病：受多个微效基因和环境因素共同影响的疾病，又称多因子病或复杂疾病。人类遗传性疾病线粒体遗传病：线粒体DNA突变可以引起的人类疾病。获得性疾病（不会遗传）13遗传学研究三大里程碑1953年发现DNA双螺旋2003年完成HGP计划2005年启动国际人类单体型图计划认识人类疾病的遗传学基础成为可能14人类基因组由30多亿个碱基对构成，负责储存人类全部遗传信息。

HGPprojectistodeterminethesequencesofthe3billionchemicalbasepairsthatmakeuphumanDNA.遗传图谱物理图谱序列图谱基因图谱GeneticMapPhysicalMapDNASequenceGeneIdentification

解读人类遗传信息Touncodethegeneticinformationofhuman......HGP计划的内容（人类基因组计划）152005启动国际人类基因组单体型图计划

(HapMapProject)16

人类基因组99.9%相同，个体间差异只有0.1%。

Thereare0.1%differentbetweentwoindividuals.单体型图计划为研究复杂疾病易感基因提供了公共突变数据库。TheHapMapprojectestabllishahumancommongeneticvariantsdatabasesforgeneticstudiesofcomplexdisease.

寻找人群中的遗传差异

Toidentifygeneticdifferencesinpopulation...HapMapPhaseI:1.3Mmarkersin269peopleHapMapPhaseII:+2.8Mmarkersin270people16疾病基因组学：在全基因组水平，鉴定与疾病有关、导致基因编码产物结构、数量、活性等改变的基因序列变异或修饰改变、及其致病机理的研究。基因结构变化、表观遗传学改变、……17Cytogenetics细胞遗传学DNASequenceDNA序列基因结构变化——遗传变异：单个碱基的变异——点突变、单核苷酸多态性(SNPs)人类存在大量SNP，但是仍可正常，故逐渐转入CNV研究

Singlebase-pairchanges–pointmutations、SNPs(SingleNucleotidePolymorphisms:3Mbdiff.betweenanytwogenomes;0.1%)小片段的插入/缺失——框移突变，微卫星...Smallinsertions/deletions—frameshift,microsatellite,minisatellite...Mobileelements—retroelementinsertions(300bp-10kb)较大片段基因组变异（重复、缺失、扩增）

Large-scalegenomicvariation/DeletionsandAmplifications(>10kb)基因组拷贝数变异(CNVs)，在常人也有，并非都与疾病有关SegmentalDuplications/deletions//

CNVs(CopyNumberVariation,Upto15Mbdiff.betweenanytwogenomes,3%)染色体变异——易位、倒位、融合基因...Chromosomalvariation—translocations、inversions、fusions...18基因组拷贝数变异

(CopyNumberVariations,CNVs)19

——基因拷贝数变异(CopyNumberVriations)是指在人类基因组中广泛存在的，从1000bp碱基对到数百万bp范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点的变异。

——拷贝数变异”(CNVs)和“单核苷酸多态性”(SNPs)是人类表型变异的两个重要潜在来源。——本实验室在儿童孤独症（Autism）研究中发现的一例CNVs变异。——Redonetal.Nature200619拷贝数变异在人类基因组中广泛存在——CopyNumberVariations(CNVs)areubiquitousinthehumangenomeSurprisingly！CopyNumberVariationsaffects12percentofthegenome!——muchmorethansuspected!

270个个体

Examining270individuals;共发现1,447个拷贝数变异

Atotalof1,447copynumbervariableregions；占人类基因组12%

Encompass360megabases,12%ofthegenome).

——Redonetal.Nature200620表观遗传学(Epigenetics)

21表观遗传学改变——指在细胞核DNA序列没有改变的情况下，基因功能发生可逆、可遗传的改变。DNA甲基化（Methylation）：在成熟体细胞中，DNA甲基化修饰一般发生于CpG双核苷酸；大约1%的DNA受到了甲基化调控；是一种表观遗传学机制，能在不改变DNA序列的前提下改变遗传表型。组蛋白修饰：组蛋白对特定氨基酸的修饰，通过蛋白质和染色质的相互作用改变染色质的结构（称为染色质构型重塑），调控基因的表达。非编码RNA（microRNAs）；一种长约21～23个核苷酸的非编码RNA分子，可以通过结合到mRNA调节其他基因的表达。21遗传变异导致疾病的机制蛋白质结构改变蛋白质活性改变剂量效应融合蛋白形成……221.基因选择性转录表达的调控DNA甲基化、基因组印迹、染色体重塑...2.基因转录后的调控1)非编码RNA:2)MicroRNA3)Antisense4)......3.蛋白质的翻译后修饰1)组蛋白的甲基化和乙酰化——Static2)组蛋白的其他修饰——Dynamic3)非组蛋白的共价修饰表观遗传因素导致疾病的机制23DNA甲基化是最早发现的修饰之一，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。E.g：DNA超甲基化遏制转录、引起基因失活。甲基转移酶催化DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5‘-CG-3’序列。生物体甲基化的方式是稳定的,甲基化位点可随DNA的复制而遗传。甲基化与肿瘤：(1)整个基因组甲基化程度很低;(2)某些抑癌基因错误的发生甲基化被沉默甲基化（DNAMethylation）24二、研究的技术与策略25基因分型Genotyping26

除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型genotype。对SNP位点而言，一个人有三种可能性，分别是AA，AG或GG。这种基因型的差异叫做单核苷酸多态性(SNP)。通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型，被称作基因分型。…TAGC……TGGC…27

几种多态标记:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs28第一代标记：RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改变甚至是一个碱基的改变，都可能改变限制性内切酶酶切片段的长度，通过凝胶电泳可以方便地检测这种长度的“多态性”。RFLP在整个基因组中都存在，根据对RFLP片段的多态性分析，可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行定位。29301980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切断DNA中特殊位点1987年，第一张较完整的人基因连锁图,包含393个RFLP位点。缺点：数目少，信息量小；成本昂贵，操作繁琐，不易发展到自动化水平。31

第二代标记:STR(shorttandemrepeatpolymorphism)，亲子鉴定的基础

例如基因组中两个或两个以上的核苷酸短串联重复序列(CA)n，微卫星标记等，在不同个体中重复单位的数目变异非常大。32微卫星标记荧光电泳图33STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是2bp-6bp的串联重复，以(CA)n，(GT)n常见。1996年建立了以6000多个STR为主体的遗传图谱，目前有10000个左右的位点。主要用于个体识别优点：信息量大；易实现自动化。缺点：标记数量不够多34随着人类基因组计划、国际人类基因组单体型计划（Hapmap计划）的完成，大量的SNP被发现。利用先进的高通量基因芯片技术，精确揭示重大疾病的基因变异，从而阐明疾病的遗传学发病机制，是目前科学界公认的最为有效的搜寻重大疾病易感基因的研究方法，被Science杂志评为2007年十大科学进展之首。35迄今已发现的SNP约900～1,000万个，相关的文章约4000余篇。特点：数量丰富双等位标记，简单的+/-分析根据结果可以估算出某个等位基因在一个群体中的频率易于实现自动化，快速筛查SNP作为遗传标记的优势363738394041定位克隆候选基因关联研究全基因组测序全基因组关联研究（SNPs,CNVs）全基因组表观遗传学研究……常用的策略42定位克隆是最通常采用的鉴定疾病致病基因的策略：即根据基因在基因组上的位置定位并克隆基因，已经被成功用来鉴定致病基因或为预测疾病提供重要依据。定位克隆研究策略43通过与遗传标记连锁定位致病基因的位置。44候选基因关联研究策略基因的功能、结构已有的研究预测可能的疾病病例--对照研究45选择tagSNPs标记单体型在病例-对照人群间比较SNPs等位基因频率全基因组关联统计分析，得出有意义的SNPs另外选择独立的病例-对照人群对初筛阶段的结果进行验证全基因组关联分析HapMap计划初筛阶段重复验证阶段利用芯片对所有tagSNPs进行基因分型46全基因组测序研究策略全基因组序列全外显子组序列全转录组序列第二代测序技术第三代测序技术海量数据分析鉴定疾病相关基因47全基因组表观遗传学研究策略病人组织

DNA正常组织

DNABisulfite处理Padlock介导的特异DNA捕获第二代DNA测序MeDIP富集甲基化基因组片段生物芯片杂交海量数据分析48三、应用49关于精神分裂症的研究50

精神分裂症是以基本个性改变，思维、情感、行为的分裂，精神活动与环境的不协调为主要特征的一类最常见的精神病。患者一般无意识和智能方面的障碍。51主要特征：幻觉、妄想、认知障碍约占所有成人精神疾患的70%；全球发病率约为1%；

中国：1986年调查，发病率为5.69‰

1998年张维熙等，终身患病率6.55‰患病率呈明显上升趋势；病情反复发作，病人本身很痛苦；巨大的经济负担、社会问题。52精神分裂症家系的致病基因定位

53精神分裂症致病基因定位—举例54精神分裂症致病基因定位—举例55精神分裂症致病基因定位—举例56精神分裂症致病基因定位—举例57一个来自河南省的精神分裂症家系，该家系29名成员，有患者9人，5男4女。所有患者都属于精神分裂症的同一亚型——偏执型。有一人（IV-7）表型不能确定。精神分裂症致病基因定位--我们的工作58常染色体显性遗传模式下两点LOD>1的位点

精神分裂症致病基因定位--我们的工作59D12S345，D12S85和D12S364附近的D12S1631，D12S1643，D12S1621等8个微卫星标记进行精细定位。同时，该家系中4个成员：IV-1、IV-15、IV-16和IV-17的样本被采集到，一并加入到精细定位研究中。

精细定位精神分裂症致病基因定位--我们的工作60MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Single-pointMultipoint

Zmaxθ=LODNPLp-valueLODNPLp-valueD12S36430.601.990.060.852.880.00977-1.120.120.20459D12S158030.601.120.14-1.510.10.21387-1.350.110.21387D12S161744.030.280.20-1.640.240.14502-1.431.040.06787D12S163150.900.80.13-0.281.310.052730.955.440.00879D12S164350.902.510.002.586.890.000980.965.450.00879D12S162152.202.330.002.435.660.006840.965.450.00684D12S164852.541.540.080.392.130.015140.965.450.00879D12S34553.091.710.080.622.890.008790.965.450.00879D12S169253.280.50.230.271.850.018070.965.450.00879D12S166855.291.140.000.950.470.091312.619.950.00098D12S168755.740.230.000.760.850.071292.6910.830.00098D12S8561.341.440.090.721.670.034180.531.610.03662家系SCZ32在Chr.12的参数分析与非参数分析结果精神分裂症致病基因定位--我们的工作61精神分裂症致病基因定位--我们的工作62

为了验证该位点，我们又收集另外15个精神分裂症的家系进行进一步研究。

精神分裂症致病基因定位--我们的工作63MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Two-pointMultipoint

ZmaxQ=HLODNPLp-valueHLODNPLp-valueD12S36430.600.710.160.381.340.088580.031.470.07020D12S158030.600.160.310.010.560.278820.031.440.07504D12S161744.030.860.160.991.600.055240.611.970.02634D12S163150.901.160.140.441.250.103992.94

3.500.00183D12S164350.901.910.081.332.620.006831.842.860.00432D12S162152.200.360.250.000.980.159290.000.990.15668D12S164852.540.240.750.000.230.399460.030.980.15886D12S34553.090.180.350.030.190.415140.000.820.20157D12S169253.280.220.320.000.490.303740.000.720.23010D12S166855.290.070.780.000.720.229500.001.140.12367D12S168755.740.440.180.141.090.135610.001.670.04852D12S8561.340.100.330.001.080.136860.001.460.07251其他15个精神分裂症家系Chr.12的参数分析与非参数分析结果精神分裂症致病基因定位--我们的工作64MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Two-pointMultipoint

ZmaxQ=HLODNPLp-valueHLODNPLp-valueD12S36430.602.630.101.032.020.023890.001.460.07007D12S158030.601.110.210.000.570.271060.001.420.07512D12S161744.031.090.180.761.610.052920.402.170.01771D12S163150.901.960.140.341.540.060613.904.750.00119D12S164350.904.15

0.053.764.260.001692.674.130.00183D12S162152.201.800.161.522.360.012180.152.320.01317D12S164852.541.220.210.000.750.213870.402.310.01340D12S34553.091.350.230.180.910.172600.292.150.01838D12S169253.280.970.220.000.940.165120.252.060.02222D12S166855.290.700.180.240.810.197621.633.600.00256D12S168755.740.600.160.561.260.098561.734.330.00161D12S8561.341.020.210.151.460.069370.011.810.03599所有16个精神分裂症家系的Chr.12的参数与非参数分析结果精神分裂症致病基因定位--我们的工作65存在的主要问题多数易感基因位点尚未分离到易感基因已克隆易感基因的确切作用不明已有研究结果很少能够被证实或重复主要原因精神疾病临床变异较大缺少大的家系样本，缺少大样本量的分析收集大家系和大量疾病资源仍是精神疾病研究的一个主要任务66精神分裂症的CNV研究67全基因组SNP分型及数据整理686970精神分裂症的CNV及Pathway研究71关于孤独症的研究72儿童孤独症简称孤独症（Autism；又称自闭症）是一种严重影响儿童的神经发育性障碍73孤独症简介孤独症起病于婴幼儿期，男童发病率高于女童；不同程度的社会交流障碍是孤独症的核心特征；回避眼神接触，对亲呢动作反应冷淡，孤僻，对同伴交往或集体活动缺乏兴趣；多数患儿表现语言发育迟缓，部分表现为语言形式和语音运用方面的异常；兴趣与活动内容局限、刻板、重复；约有四分之三的患儿伴有明显的精神发育迟滞；男女比5：1有部分孤独症患儿在一般性智力落后的背景下又出现“孤独性才能”，在音乐、计算、推算日期、机械记忆和背诵等方面呈现特殊才能。74孤独症病因学研究概况流行病学研究显示，遗传因素、脑器质性因素、神经生化因素、孕产期病变、感染及免疫等多方面原因可能与孤独症有关，其中遗传因素为大多数科学家所公认。城市高于农村，军队高于地方，高文化层次者的子女更好发。据报道，同卵双生共患孤独症的几率为60-80%，异卵双生的共患几率为3-10%，同胞患孤独症的几率为3-5%，是群体中孤独症发病率的50-100倍。根据以上孤独症家族聚集性、患者同胞再患的危险度和同卵双生、异卵双生共患的差异推断：90%以上的孤独症是由遗传造成的。75孤独症的GWAS研究76Feasibilityofidentifyinggeneticvariantsbyriskallelefrequency

andstrengthofgeneticeffect(oddsratio)TeriAetal.2009NATURE77自闭症全基因组关联分析（GWAS）7879初筛阶段第二阶段芯片平台：illumina550943个家系，4444个个体筛选后剩下：780个家系，3101个个体（Europeanancestry）提示2个可能的易感基因：CDH9、CDH10合并数据分析发现6个关联SNP，分别位于2个基因上1453个患者，7070对照筛选后剩下：1204个患者，6491对照（Europeanancestry）芯片平台：illumina550自闭症全基因组关联分析（GWAS）研究结果进一步在他人的样本中得到证实80自闭症全基因组关联分析（GWAS）81自闭症全基因组关联分析（GWAS）82自闭症GWAS后续研究策略——更大规模（不同人种）样本验证生物信息学分析鉴定潜在的致病Alleles多层次的功能学验证分子水平、细胞水平、动物模型...揭示自闭症的分子致病机制通过GWAS研究提示与疾病关联的SNPs...83孤独症的CNVs研究84858687罕见CNV分析88以CNV研究为基础的基因关联研究新发CNV/来自于亲本的罕见CNV区域中与疾病相关的候选基因举例89CNV区域候选基因功能研究与疾病相关的微缺失区域中基因家族一览90疾病相关主要基因家族详图91ASD相关基因功能图谱92GWAS研究存在的不足93PublishedGenome-WideAssociationsthrough6/2010,904publishedGWAatp<5x10-8for165traits/GWAStudies9495存在的问题发现的疾病关联SNPs大多位于基因间或者内含子上，很少位于功能区的SNPs（如外显子和5`非翻译区）芯片的局限性数量限制，仅覆盖全基因组中SNPs的15%左右仅能发现疾病的常见变异，对少见变异不够敏感对基因表达调控和基因组修饰作用的研究还有待深入96基因组转录组蛋白质组表观遗传？？？人类疾病97神经影像学与遗传学随着精神疾病研究的发展，神经影像学与遗传学相结合的研究方式成为目前研究的新方向98对中间表型的研究儿茶酚邻位甲基转移酶(CMOT)与多巴胺能神经传递COMT影响与疾病相关的负面情绪状态5-羟色胺转运体可用性和情绪调节新的遗传变异改变5-HTTLPR蛋白的表达和功能神经影像学与遗传学99儿茶酚邻位甲基转移酶(CMOT)100101儿茶酚邻位甲基转移酶(CMOT)COMT使儿茶酚胺甲基化，是dopamine和homovanillicacid等等神经递质降解级联反应中的一个环节在小鼠、大鼠和猴的基因敲除实验中发现，COMT在前额页皮质中突触内dopamine调节起着至关重要的作用；COMT和记忆表现以及任务相关的工作记忆相关102儿茶酚邻位甲基转移酶(CMOT)最新的研究发现，COMT基因的一个功能性多肽与复杂精神疾病相关G1947A，valine-to-methionine(Val108/158Met)导致COMT活性降低75%，导致dopamine快速降解作用的减少103Figure2.CorrelationbetweenCOMTmet158alleledosage(0val/val,1val/met,or2met/met)andactivationbyunpleasantstimulioftheventrolateralPFC(A),rightamygdala(B),andleftdorsalhippocampus(C).Left,Statisticalmapsareshown(p0.05correctedforvolumeofmask;clustersize10voxels).Right,NeuralresponsesofindividualsaredisplayedrelatedtoCOMTgenotype.IndividualBOLDresponseswereextractedfromthevoxelwiththehighesttvalueinsidetheclusterencircledattheleft.104儿茶酚邻位甲基转移酶(CMOT)COMT基因作为多巴胺功能障碍精神分裂症以及前额页皮质功能障碍的候选基因而被广泛进行关联研究部分研究小组的结果表明，Val等位基因与精神分裂症阳性相关，但也有一些研究小组得到相反的结果105发展趋势1

全基因组测序研究106106研究策略

受累个体及正常对照外显子组或全基因组测序

dbSNP和HapMap过滤合适的筛选策略找到候选基因Sanger测序验证候选基因突变107108BackgroundDNAGenomicDNAFragment

&addlinkersHybridizeNimbleGenArrayWashEluteSequencingProbesTargetDNATargetDNAExon1Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6Amplification108DenaturationwithNaOHbeforeaddingtoFCInitialextensionwithTaqPolymerase109110DenaturationwithformamideSubsequentamplificationwithBstpolymerase35cyclesat60oC1115’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:AddsequencingreagentsandrepeatAllfourlabelednucleotidesinonereactionHighaccuracyBase-by-basesequencingNoproblemswithhomopolymerrepeatsSequencingBySynthesis(SBS)112TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages.123789456113发展趋势2

全基因组表观遗传学研究114114DNA的提取和纯化、片段化免疫磁珠法分离样品中甲基化DNA片段的抗体复合物纯化免疫共沉淀的DNA片段扩增、荧光标记与甲基化芯片杂交扫描、读取结果加热变性后向单链DNA样品加入抗5’-甲基化胞嘧啶核苷抗体115全面系统地鉴别精神疾病患者的甲基化标记，将发现一些尚未报道过的受启动子甲基化影响的基因。116总之,基因的表达受到染色体结构变化的调控,由此可导致疾病的发生发展,而人类对此机制尚缺乏系统、完整的认识。深入理解疾病形成的表观遗传机制是从新的视角认识疾病,未来将会开启疾病治疗的另一扇大门。117夏昆xiakun@xiakun48@

118MissingheritabilityDiseaseNumberoflociProportionofheritabilityexplainedHeritabilitymeasureAge-relatedmaculardegeneration550%SiblingrecurrenceriskCrohn’sdisease3220%Geneticrisk(liability)Systemiclupuserythematosus615%SiblingrecurrenceriskType2diabetes186%SiblingrecurrenceriskHDLcholesterol75.2%Residual*phenotypicvarianceHeight405%PhenotypicvarianceEarlyonsetmyocardialinfarction92.8%PhenotypicvarianceFastingglucose41.5%PhenotypicvarianceEstimatesofheritabilityandnumberoflociforseveralcomplextraitsTeriAetal.2009NATURE119Whereisthemissedheritability?RarevariantswithsubstantialeffectsizeLowminorallelefrequency(0.5%<MAF<5%)orofrarevariants(MAF<0.5%)StructurevariationsCNV,neutralstructurevariation(inversion,translation)Epistasis(gene-geneinteraction)Genotype–environmentInteractionsEpigeneticsThousandsofvariantswithsmalleffectNotmissingheritabilityetc……Speculations:120Howtofindthemissedheritability?(1)Highresolutionarray8millionpreviouslyunknownvariants1millionstruct