食用菌的消毒与灭菌

第六章食用菌的消毒与灭菌第一节培养基质的消毒与灭菌第二节接种与培养环境的消毒与灭菌

第三节别离材料和皮肤外表的消毒

第四节其他灭菌法消毒与灭菌的概念消毒：是指用物理或化学的方法，杀灭物料中、物体外表及环境中的局部微生物。灭菌：是指用物理或化学的方法，彻底杀灭物料、容器、用具和空气中的所有微生物。防腐：是指用物理或化学的方法，暂时抑制微生物的生长。除菌：是一种用机械的方法除去液体或气体中微生物的方法。消毒、灭菌的方法物理方法：热力灭菌、辐射灭菌、过滤除菌化学方法：利用化学药品对器皿、工具等进行浸泡，对环境进行喷洒、熏蒸生物方法：利用生物来抑制或杀灭有害生物，或利用生物制剂来抑制或杀灭微生物在食用菌生产过程中，必须对培养基、接种工具及其他用品、接种室、培养室等工作场所进行可靠的灭菌或消毒。消毒、灭菌设备就是利用热力、射线等杀菌手段进行消毒或灭菌。目前，对培养基、工作衣等常用高压蒸气灭菌；金属接种工具采用火焰灭菌；玻璃器皿采用干热灭菌。而对一些不耐温、体积庞大的培养基和物品，常采用射线和紫外线等辐射灭菌。对热不稳定的生化药品如酶制剂、维生素的水溶液等，那么采用过滤除菌。第一节培养基质的消毒与灭菌培养基灭菌法：用热力或其他方法，使培养基到达无菌状态的方法。经过灭菌的培养基，要求养分不受破坏，并彻底灭菌。这就要根据其物理形态、容器和设备的不同，选用相应的方法灭菌。

高压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌沸水消毒法生物消毒法拌药消毒法根据培养基的物理形态、容器和设备的不同，选用相应的方法灭菌。

1、固体培养基：可采用高压蒸汽或常压蒸汽灭菌。2、固化培养基：应采用高压蒸汽灭菌。3、液体培养基：瓶装液体培养基的灭菌方法与固化类型培养基相同；发酵罐的液体培养基是采用通高压蒸汽在罐内直接灭菌；含热不稳定物质的液体培养基，可采用过滤除菌法。一、热力灭菌灭菌原理：利用高温使菌体蛋白质变性，从而使酶失去活性，到达灭菌的目的。方式湿热灭菌干热灭菌高压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌沸水灭菌间歇灭菌火焰灭菌干热高温灭菌1.高压蒸气灭菌高压蒸汽灭菌是利用灭菌锅内的高压高温蒸汽进行灭菌

压力指标：液体培养基1.0Kg/cm2或0.098Mpa30分钟固体培养基：1.5Kg/cm2或0.147Mpa2小时优点杀菌彻底，灭菌时间短，使用广泛缺点需要专门的设备，一次灭菌量少，本钱高，过高的温度易破坏基质中的营养高压灭菌锅是密闭耐压的金属灭菌容器。其工作原理是在驱尽锅内空气的前提下，通过加热把密闭锅内的水蒸气压力升高，从而使蒸汽温度相应提高到100℃以上。压力在98Pa时，蒸汽温度可达121℃。常见的高压灭菌锅有手提式、立式与卧式，也有自制的高压灭菌锅。手提式主要用于一级种制作，立式和卧式主要用于二级种、三级种和栽培瓶、袋的制作。

手提式高压灭菌锅的容积小，适用于试管培养基、三角瓶或平皿、无菌水、少量菌种瓶及一些器皿的灭菌。手提式高压灭菌锅立式高压灭菌锅容量大，可用于菌种瓶、罐头瓶及塑料袋装培养基的灭菌。立式高压灭菌锅电热高压蒸汽灭菌锅卧式高压灭菌锅容量大、盛物多，灭菌彻底，效果好。卧式高压灭菌锅高压蒸汽灭菌锅蒸汽工作压力与蒸汽温度的关系高压蒸汽灭菌：15psi=1.05kgf/c㎡=103.4kPa=0.10MPa，121℃；20psi=1.41kgf/c㎡=137.9kPa=0.14MPa，126℃；25psi=1.76kgf/c㎡=172.6kPa=0.17MPa，130℃；30psi=2.11kgf/c㎡=206.8kPa=0.21MPa，135℃；

常压蒸汽灭菌：1atm，100℃2.常压灭菌常压灭菌：以自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。灭菌时间：熟料100℃6~24小时，半熟料2小时。常压灭菌灶是在自然压力下产生100℃蒸汽进行灭菌的炉灶，如土蒸锅。常压灶制作简单，造价低，很受菇农欢送。常压灭菌灶设计的主要技术要求是:

灶体大小依生产规模而定，视需要配置1-2口盛水锅。灶仓砌墙范围比锅的直径宽20cm左右，灶仓内墙壁用水泥精细粉刷，灶顶圆拱形，以使蒸汽冷凝水沿仓壁下流，防止打湿灭菌物品。灶仓内要有层架，以便分层装入灭菌物品。具有湿度测试装置，一般放在灶体中部小门中间。具有加水装置及观察或测试灶内水量的装置。优点缺点灭菌灶可自行建造，容量大、结构简单、本钱低灭菌时间长，能源消耗大，操作稍有失误就会有灭菌不彻底的情况发生3.常压间歇灭菌指用常压蒸汽分阶段灭菌，中间间歇一定时间，连续灭菌几次才到达灭菌效果的方法。用于没有高压蒸汽灭菌设备，或者对一些不宜用100℃以上高温灭菌的培养基。方法100℃热蒸气30~120分钟，20~25℃条件培养24小时，诱发菌丝，再灭菌30分钟，连续3次。4.沸水消毒法将使用物品或培养基放入沸水中煮沸一段时间的消毒方法，多用在食用菌接种工具、器材的消毒。可在几分钟内杀死不耐高温的微生物营养体；二.生物消毒法〔发酵杀菌法〕

原理：根据巴氏消毒的原理，采用培养料堆制发酵的方法进行灭菌，即大多数微生物在60℃-70℃温度下，经过一段时间失活，从而到达消毒的目的。对蘑菇培养料后期的巴氏消毒，在60～62℃下维持4～7小时，不仅能杀死培养料中大局部有害的虫卵和杂菌，而且可提高蘑菇对培养料的选择性。三、拌药消毒常用药物0.1%的多菌灵，0.1%甲基托布津，1~2%的生石灰。灭菌效果的检测抽取几支灭菌后的斜面试管或几瓶固体培养基，置于25-30℃下培养5天左右，如培养基外表和内部无任何变化那么说明灭菌效果好，可直接使用。假设培养基外表发生杂菌污染，那么说明灭菌失败，必须重新灭菌或处理掉。第二节接种与培养环境的消毒与灭菌一、化学药剂消毒灭菌1.氧化剂杀菌机理：通过强烈的氧化作用，破坏微生物的原生质或酶蛋白质结构。常用药物：2-5%高锰酸钾、5%漂白粉、0.5-1%过氧乙酸过氧乙酸：通过破坏微生物的蛋白质分子结构杀死微生物。漂白粉：易与蛋白质或酶发生氧化作用使菌类致死。高锰酸钾：使微生物蛋白质变性，酶失活，导致菌体的芽胞死亡。应用于环境及物品消毒。

3.复原剂甲醛：与微生物细胞蛋白质的氨基酸结合，引起蛋白质变性，使细胞原生质失去生理活性。应用：环境消毒4.外表活性剂杀菌机理是改变细胞透性。常用药物是乙醇石炭酸来苏儿新洁尔灭等石炭酸〔苯酚〕：在高浓度下可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝聚沉淀，在低浓度下可使细胞的主要酶系统失去活性，到达杀菌作用。5%的水溶液喷洒消毒。来苏水：1-2%溶液用于皮肤浸泡，3%用于喷洒消毒。5.其它消毒剂石灰硫磺气雾消毒石灰：提高培养料或环境的pH，抑制大多数酵母菌及霉菌的生长繁殖而到达消毒目的。硫磺：二氧化硫与水生成亚硫酸，亚硫酸能夺取菌体细胞中的氧，导致细胞代谢功能障碍而死，具有杀菌作用。用于空间密闭室内消毒。气雾消毒：利用某些化学药物加热或燃烧产生的具有强烈杀菌作用的气体，对食用菌生产中常见的木霉、根霉、黄曲霉等杂菌有强烈杀灭作用。应用在对空间和物体外表进行消毒和灭菌。二、室内空间杀菌1.紫外线杀菌原理：利用辐射能量进行杀菌的方法。紫外线波长在260nm左右可导致细胞内核酸和酶发生光化学变化而使细胞死亡。另外，紫外线可使空气中氧气产生臭氧，臭氧也具有杀菌作用。紫外线灯：杀菌有效范围半径1.5m内，时间30分钟。使用于空气和物体外表消毒。本卷须知：2.药物薰蒸甲醛和高锰酸钾多菌灵气雾消毒剂等三、接种环境除菌超净工作台和无菌箱超净工作台是一种局部层流(平行流)装置，它能在局部造成高洁净度的工作空间；使小房间内的空气经预过滤器和高效过滤器除尘、洁净后，以垂直或水平层流状态通过操作区，因此，可使操作区保持既无尘又无菌的环境。

接种箱是用木材与玻璃制成密闭箱。有单人式或双人对接式。接种箱前后斜面为玻璃窗，便于操作时观察，可开启，以便取放物品。玻璃窗下的木板有一对椭圆形开孔，操作孔装有白布袖套，一端固定在圆孔上，另一端套口用松紧带箍住操作者的手腕·，以防杂菌进入。箱内可安装20W日光灯和30W紫外线灯管。

四、室外环境消毒喷洒杀菌药液消毒甲醛多菌灵喷洒杀虫药液杀虫敌百虫磷化铝溴氰菊脂等地面撒石灰消毒

消毒效果的检验1.对消毒场所空气的检验方法平板检验法：用培养食用菌的常规PDA培养基或肉汤琼脂培养基作成数个平板，灭菌后放入测试场所，将其中的平板翻开15min、20min、30min后再盖好，另外1-2个不开盖作对照。然后放在30℃下培养48小时检验有无杂菌生长。斜面检验法：2.紫外线灯消毒效果检验紫外线强度的检验：碘化钾法紫外线可将碘离子氧化成碘，碘与淀粉变兰色。将浸有淀粉和碘化钾溶液的试纸置于紫外灯下照射，根据颜色变化的深浅判断紫外线的强弱。紫外线对空气消毒效果检验：分别在不同位置和不同高度放置平板培养基。按平板检验法检验空气中的杂菌，以判断紫外线的消毒效果。一、别离材料的外表消毒重金属盐类杀菌机理：带阳电极易与带负电荷的蛋白质结合，使细胞内蛋白质凝固变性，低浓度重金属离子与酶或某些活性物质的活性基团如硫氢基结合，可使需要硫氢基团的酶失去活性，致使菌体死亡。第三节别离材料和皮肤外表的消毒升汞将子实体或菇木在0.1%的升汞溶液中浸泡2分钟，取出后，用无菌水反复冲洗。0.1-0.2%的升汞溶液对玻璃器皿及非金属器械进行消毒。二、外表消毒杀灭酒精降低外表张力，改变细胞膜的透性及原生质的结构状态，干扰微生物的新陈代谢，使蛋白质凝固变性，抑制其迅速繁殖。应用：75%的水溶液浸泡或涂擦物品外表，作用时间5-6分钟。新洁尔灭改变细胞的渗透性，使菌体破裂、蛋白质变性，破坏菌体内的各种酶系统，影响细菌的新陈代谢。应用：0.25%的水溶液用于皮肤及物品外表消毒；0.1-0.5%的溶液进行喷洒，浸泡擦抹，用于环境消毒。特点：快速、彻底、高效墙壁、台面、菇床的外表消毒2%~5%的漂白粉洗刷或2%~3%的来苏儿、0.25%新洁尔灭洗刷，生石灰涂洒。三、干热灭菌火焰灭菌法：将能耐高温的物品放在火焰上灼烧，使附在物体外表的微生物死亡的方法。用于接种工具和试管口、瓶口的消毒杀菌干热灭菌法：利用高温干热的空气使微生物死亡，从而到达灭菌的目的。用于固体材料的灭菌，如器皿的杀菌，160℃~170℃，2小时。其他灭菌法X—射线、γ—射线等电离射线虽可用于灭菌，但因这类射线的产生需要昂贵的专用设备，无法在菌种生产中应用。微波灭菌技术近年，在蕈菌生产中，还出出了一些用新的方法进行灭菌的尝试。例如，波长1000μm—1000mm电磁波〔微波〕的电场对微生物细胞中的水分子能产生极化作用，极化后的水分子会随微波电场方向的改变而转动，在转动过程中分于之间的高速摩擦产生热能，这种热能不同于外部加热，可在物体本身的温度权略微增加的情况下使微生物细胞暴破，从而到达灭菌的目的。电子消毒、灭菌技术以“高效臭氧发生管〞为核心部件的所谓电子消毒、灭菌器，利用高压放电原理，使空气中的氧电离，生成游离的氧原于，并与空气中的氧结合形成臭氧气体。臭氧是一种强氧化剂，具有强烈的氧化作用的臭氧迅速扩散并深入掺透到微生物细胞壁内之后，能使菌体蛋白变性并破坏菌体的酶系统，从而使微生物细胞失去活力。

从理论上讲，上述灭菌方法均不无道理，但总的说来，这些新的消毒、灭菌方法尚处于试验、探索阶段。一系列实际问题，例如，其实际使用效果及适合范围究竟如何，设备的结构及功能应作哪些改进等等，都有待在今后的实践中研究解决。消毒剂：具有杀菌能力的化学药物叫做消毒剂，亦称杀菌剂。食用菌生产中常用的消毒剂如下：乙醇(酒精)常用浓度：70％

福尔马林(40％的甲醛水溶液)苯酚(石炭酸)5％

煤酚皂溶液(来苏尔)1％～3％

新洁尔灭0.25％

波尔多液漂白粉(次氯酸钙)2％～5％

消毒剂一般只对细菌的繁殖体有效，而对于芽孢很少有杀死作用。硫磺高锰酸钾0.1％过氧化氢(双氧水〕过氧乙酸(过氧醋酸)0.2％～0.5％〔喷雾〕，5ml/m³〔熏蒸〕消毒剂名称用途用量和使用方法注意事项甲醛溶液（HCHO）Formalin空间或表面消毒熏蒸8～10ml/m3喷雾2%溶液1．有白色沉淀时加几滴硫酸溶解2．注意皮肤和眼睛的防护3．先用来苏尔溶液空间喷雾再用甲醛熏蒸效果更好硫磺（S）sulphur空间消毒15～20g/m3燃烧熏蒸1．消毒空间时先喷水预湿2．金属用具易锈蚀应防护酒精（C2H5OH）Alcohol手及器皿表面消毒70%~75%易燃，注意按实验室操作方法使用常用消毒剂使用方法高锰酸钾（KMnO4）potassiumpermanganate1．甲醛熏蒸助蒸剂2．用品器具表面消毒1．5ml/m32．0.1%~0.2%水溶液随用随取随配来苏尔（C6H4CH3OH）lysol手和器皿表面消毒，空间喷雾1．浸泡容器用3%水溶液时间1h2．洗手和空间喷雾用2%水溶液亦称煤酚皂新洁尔灭（C22H40BrN）Bromo-geraminum皮肤和不耐热的器皿表面消毒0.1%~0.25%水溶液亦称苯扎溴铵，系阳离子表面活性剂。避免与阴离子表面活性剂（如肥皂、合成洗涤剂等）合用洗必泰（C12H30