高效液相色谱操作手册

HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项:使用前，应申明样品名称和特性以及使用的流动相。更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。溶剂必须经微孔滤膜过滤，所有废弃物（溶液等）请带走自行处理不得在计算机上进行与实验无关的操作。注意适时更换废液收集瓶，防止废液溢出。认真登记实验记录。相关论文发表后，应送一份复印件给中级仪器实验室。北京大学化学学院中级仪器实验室、概述HPLC1100系统构成如下:1流动相ABCD2真空脱气装置3、6、9、11电缆4输液泵5自动进样器（无）7柱温箱 8检测器（DAD）10数据接收处理控制系统（计算机）12打印机13手动进样器1.指示灯状态LED灯显示绿色;NotReadyRunErrorLED灯显示绿色;NotReadyRunErrorVacuumchamberlosamplingunitandcolumn*Iowaste每个部件接通电源后,黄色绿色红色四元泵系统的工作原理图■*—FfornZ—so^venl*~botU辟Damper柱温箱的特征可以在低于室温10°C至80°C间恒温空间大，可以容纳三根30cm长的柱子安装柱识别可以记录进样次数两个单独的加热区可以程序升温检测器HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示:windowTungstenlampCoupljiiglensEMuteriumbtnpAchromatIsourcelens]TungstenlampCoupljiiglensEMuteriumbtnpAchromatIsourcelens]Holnuurn™(fefiHerFlowcellSpecUvlenssi5~Diodecrating光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后，照射到流通池上，透射光经全息凹面衍射光栅色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件，它有三个动作位置：（1）光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；（2）将氧化钦滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；（3）打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成，熟悉软件十分重要。本系统操作是基于WindowsNT的多窗口多任务操作系统，要注意窗口之间可能覆盖。根据所选色谱柱的性能，本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱（可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析）。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口，大连化物所及天津Autoscience公司可提供，一般分析柱的价格在1600—2000元之间，HP进口柱价格在4000元人民币左右。本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗，但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。二、开机打开各部分电源，脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。开启计算机，若有选项，选择开启WindowsNT4.0。点START—PROGRAM—HPChemStation—Instlonline，计算机开始与仪器联接，并打开各控制界面，此时，各单元指示灯变绿，在工具条的View中选择界面为Runcontrol。在第一个小窗口中利用下拉菜单，选择显示界面为MethodandRunControl；在第二个小窗口中选择已设定的使用方法（若是旧用户则有记录），新用户先编辑实验方法，然后选工具栏中Method—SaveMethodAs（具体见后）。第三个小窗口中显示LC操作条件。三、样品分析1．溶剂的处理和设置不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命：使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌用滤膜过滤溶剂去除微生物每二天更换或过滤溶剂避免溶剂瓶直接日照各洗脱液应分别过滤，注意有机相和水相应使用不同的滤膜。避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物在有机溶剂中的有机酸溶剂含有强络合剂的溶液四氯化碳和异丙醇或THF混合物溶剂的设置：在输液泵图标上按鼠标左键，在出现的小菜单中选SetupPump，在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称；点溶剂瓶图标，在SolventBottlesFilling中输入A、B、C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。2．设置泵的参数点输液泵图标，选SetupPump，出现流速控制界面。设定流速flowrate（一般ODS柱为lml/min）；设定A、B、C、D各溶剂比例，其中B、C、D可设置。0K。点输液泵图标，选pumpcontro1,点ON打开泵，0K，泵即开始工作，图标亦变为绿色。泵压一般不要超过l50bar。若要设置各种淋洗变换程序如梯度洗脱，点输液泵图标，在此界面下面的空栏中，用Append添加一栏，依次输入时间、浓度、流速。可用Cut删去某一行或多行。设定好后，点0K退出本界面。其压力及时间程序过程在图标上的指示框里显示，3．设定柱温在柱子图标上按鼠标左键，选SetupColumnThermostat设置柱温，可在室温以下l0度至80度稳定控制，精度达到0.1度。设定后点OK退出，再点此图标，选Control打开恒温器。但若设定温度后直接点OK,则出现一英文对话框，询问是否打开温控,按yes钮即可。一般温度设置在30－50度之间。若不需控温，则在SetupColumnThermostat窗口中选notcontrol。4．检测器参数设定注意：为了延长氘灯和钨灯的使用寿命，在开始分析前进行预平衡时（每次分析前最好用待用流动相平衡20个柱体积以上）或所有分析完成后淋洗色谱柱时，不需打开

检测器，仅在分析样品前10分钟左右打开即可。因此，在检测器的control窗口中，一定不要选择Atpoweron,turnUV/VISlampon在检测器图标中按鼠标左键，选SetupDADSignals，出现检测器参数设定窗口，在此设定存储及检测信号：每一谱图可选5个通道（A、B、C、D、E）检测。若需某个波长的信号，则在任一通道的小方框中打上X,然后设定检测波长及参比波长。其它参数如波长范围、时间、灯开关等，基本都不用变化，若需变化请与工作人员联系。完成后点OK退出。注：一般情况下可将参比波长OFF,（点▼即可）。为减少噪音，可选择待分析化合物吸收为零处的某一段波长为参比波长。若想鉴定某化合物纯度，若其吸收光谱为 ，可选检测在入2，参比在入，因为—定，若为纯化合物，所测色谱峰为 形。为便入2 入1于观察，可再在检测器图标下选择On-Spectra，可观察到检测器中的紫外可见吸收光谱图。常用溶剂的紫外吸收UVCutoff(nm)190190195200210UVCutoff(nm)190190195200210210220220240265280(210)210AcetonitrileWaterCyclohexaneHexaneMethanolEthanolDiethylEtherDichloromethaneChloroformCarbonTetrachlorideTetrahydrofuranToluene5．积分仪的设定在此项中可以设定各积分参数，选择积分开始及关闭的时间，峰宽（peakwidth）,最小面积（areareject），最小高度（heightreject）等，可以象在word的表格里一样，插入、删除一行，选择不同时间开始不同值等，完成后按Out图标并选择存盘。6．进行定量分析时，选Calibration项设置7.报告格式窗口（Specfyreport）定义计算的参数显示方式（默认为Screen），其中信号设置（signalsetup）部分要检查修改，一般在range中选autoscale，但多个样品要互相比较时，建议第二个样品时改为userange（这些处理可在DataAnalysis中进行，即在完成分析后处理数据时进行）。完成后OK退出。全部设定完成后，在工具栏下Method/SaveMethodAS，将本方法存入指定位置，其中路径选择方法：C：\HPCHEM\HP\1\METHODS\专业名（Analytical、Inorganic、Organic、Physical、Polymer）\文件名.序号文件名为操作者姓名缩写（不要超过八个字符）。至此完成方法编辑。8．输入样品信息在工具条上选RunControl—Sampleinfo,输入操作者姓名及样品的有关信息。其中：Datafile一栏为数据文件的保存路径和文件名，要求在Subdirectory中输入自己的专业（统一为Analytical、Inorganic、Organic、Physical、Polymer）；文件名输入方式选Prefix/Counter,在Prefix中输入操作人姓名缩写，在Counter中输入自己文件的顺序号。顺序号会自动累加，连续测样时，只要输入第一个样品的顺序号即可。注意Path：C：\HPCHEM\1\DATA\不须更改。在SampleParameters一栏中只要输入SampleName，其它不要改。在Comment中输入流动相组分、比例等信息。输入完毕后，点OK退出。9．进样在View中选Method&Runcontrol，并选择OnlineSignal/Windowl,设置至合适的位置，观察窗口基线的情况，若漂移在窗口坐标为0—50mAu时能平稳，输液泵、柱温箱、检测器三个图标均为绿色，状态显示为ready，即可进样。OnlinePlot窗口可通过Change调节显示信号范围；Adjust调整基线位置；Balance为检测器调零（不要乱用！可在分析样品前调一次）。进样口在仪器右侧，本仪器上配有手动进样器，进样环体积为20uL，进样注射器须使用平针头的注射器，不能用尖针头！！用干净的进样器（或配专用针头的注射器）用溶剂在LOAD位置将进样环及其它部分洗净，装入样品，若进样量＜20uL，请使用实验室提供的50uL微量进样器；若进样量只要求20uL，则可用本实验室提供的针头加上自备的注射筒。样品注射后，快速将进样阀从LOAD位置顺时针旋转至INJECT位置，然后再取下注射器，并用干净溶剂将注射器清洗干净备用。在INJECT位置样品环中的样品被淋洗液带入高压系统，计算机将自动开始记录数据及分析。在确认所有样品组分淋洗出来后，在Runcontrol中选Stop（或F8）完成分析。计算机将根据设定的积分方式及格式显示分析结果，此时可选择打印出来，或不打印点Close，回到主画面。重复上述步骤进行多个样品分析。注意样品信息的修改和数据文件名的记录。手动进样器的扳手每次从Load位置扳到Inject位置时，计算机便自动记录数据，直到点stop终止，所记录数据作为一个文件自动保存。由于计算机的硬盘空间有限，实验结束后，请及时删除无效文件，尽快处理有效文件，本实验室只负责保存六个月！四、数据处理在第一个下拉菜单窗口，选择DataAnalysis，点LoadSignal图标，选择并打开文件。Graphics SignalOptions，可以根据需要选择作图选项；Integration IntegrationEvents，可以设定积分条件，点保存图标后，仪器将自动根据积分条件显示出最新积分结果；Spectra SelectPeakApexSpectra,然后用光标点一下色谱图上某个峰，即显示该峰光谱图。Spectra SelectSpectrum,显示任一点处的光谱图Report PrintReport，在屏幕上显示报告预览，若合适，点Print即打印。在不开仪器主机情况下，可进入Start/Program/HPChemstation/InstrumentlOffline进行数据的处理，其窗口与图标，非常形象，可根据需要选择进行分析后打印。五．关机分析测试完成后，对于ODS柱，应用100%色谱纯甲醇清洗柱子20分钟（ImL/min）；将进样注射器洗净并放好。将显示屏上各色谱单元的图标（泵、柱温箱、检测器等