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文档简介

大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法掌握质粒DNA制备的方法和原理实验原理

质粒DNA的提取分为三个步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二万基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可得到质粒DNA。实验材料、仪器与试剂材料：大肠杆菌DH5α仪器：

1.5mL塑料离心管（又称Eppendorf离心管）微量加样器台式高速离心机恒温摇床冰箱

实验材料、仪器与试剂试剂：PH8.0的G.E.T缓冲液：内含50mmol/LEDTA、25mmol/LTris-Hcl用前加溶菌酶4mg/mLPH4.8的乙酸钾溶液：内含60mL5mmol/LKAc、11.5mL冰醋酸、28.5mL蒸馏水，该溶液中钾离子浓度为3mmol/L，醋酸根离子浓度为5mmol/L

实验材料、仪器与试剂酚-氯仿混合液（体积比1：1）酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其体积分数为0.1%，并用Tris缓冲溶液平衡两次。向氯仿中加入异戊醇，使氯仿-异戊醇体积比为24:1

TE缓冲溶液（PH值8.0）内含10mmol/LTris-Hcl、1mmol/LEDTA,令含RNA酶20ug/mL0.2mol/LNaoH溶液（内含1%SDS）70%乙醇溶液/无水乙醇实验过程1.培养细菌扩增质粒：

将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃过夜培养2.收集菌体及裂解细菌:取液体培养菌液1.5mL置于EP管中，10000r/min离心1min,去上清。加入150uLG.E.T缓冲液，充分混匀，室温放置10min（溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时重新配置，使用EDTA是为了除去细胞壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触）。加入新配置的0.2mol/LNaoH溶液（内含1%SDS）加盖，倒置2-3次，使之混匀。冰浴5min（SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）。3、分离纯化质粒DNA加入150uL冷乙酸钾溶液，加盖后倒置数次使其混匀，冰浴15min。10000r/min离心15min，将上清倒入另一支干净的离心管中。（乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，冰浴15min是为了使沉淀完全。如果上清经离心后仍浑浊，应混匀后再冷却至0℃并重新离心处理）。向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液，震荡混匀，以10000r/min离心2min,将上清转至新的离心管中（用酚与氯仿的混合液除去蛋白，其效果比单独使用酚或氯仿更好)向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀。室温放置2min后，离心5min倒去上清乙醇溶液，把离心管倒置在吸水纸上吸去液体。加入0.5mL70%乙醇溶液，震荡并离心，倒去上清，干燥，溶于TE缓冲溶液中，-20℃保存实验注

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