一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能课件

激光扫描共聚焦显微镜

（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）--基本原理及实例应用西7-1032015-10研究生细胞生物学技术一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能一种观察工具，需要前面的实验做基础免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染……激光扫描共聚焦显微镜

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM什么是LSCM用来做什么？？一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能它和荧光显微镜的关系？它和电子显微镜的关系？观察的信号如何而来？激光扫描共聚焦显微镜

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦显微镜的原理第一部分一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物品之影像放大,而能被观察的工具。目镜光源聚焦旋钮光阑和聚光器载物台物镜显微镜（Microscope）一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。荧光显微镜

FluorescenceMicroscope照相装置光源（汞灯）标记了荧光的样品基本原理紫外、蓝、绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光分光镜(长通短反)物镜一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能共聚焦显微镜成像物镜标本针孔（pinhole）焦平面普通荧光显微镜成像一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光扫描共聚焦显微镜

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。光源光学原理成像原理基于的平台激光针孔的共轭聚焦技术断层扫描荧光显微镜系统一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

激发光源一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

光学原理荧光显微镜光源针孔检测针孔激光共聚焦扫描显微镜分光镜光源检测器标本物镜一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能分光镜不在焦平面的发射光位于焦平面的发射光物镜激发光线激光器/theory/双针孔光源针孔、检测针孔双针孔共用物镜的焦点荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

光学原理共轭聚焦移动激光扫描器，逐点扫描扫描点光源一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光显微镜系统样品荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

成像原理激光扫描共聚焦系统断层扫描技术，逐点逐行扫描成像CCD成像技术，一次性成像X光机CT机一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能普通荧光显微镜激光共聚焦显微镜特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

基于的平台--显微镜系统特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦PMT检测器—伪彩色灵敏度高光信号-电信号-图像由计算机精确控制图像的合成和输出，同时电信号增加放大倍数。多通道荧光采集一般3个荧光通道和一个透射光通道，分别成像荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

基于的平台—获取图像方式荧光显微镜目镜或CCD—真彩色所见即所得单通道荧光采集一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光显微镜VS激光共聚焦显微镜

基于的平台—获取图像方式伪彩色一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。激光扫描共聚焦显微镜

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。激光/光学显微镜结合，高灵敏度探测器，高性能计算机/图像处理软件相结合的新型高精度显微成像。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光扫描共聚焦显微镜的优缺点一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能1957年，MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜的发展一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能目前常见的激光共聚焦显微镜一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦显微镜构成扫描器系统荧光显微镜系统计算机图像存储与处理系统ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ZeissLSM-510ConfocalSystem

一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ZeissLSM-710ConfocalSystem

一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦显微镜的功能第二部分一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦显微镜的功能ZOOM成像薄层光学切片荧光定量分析多维度成像多通道同时扫描……一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能薄层光学切片激光共聚焦显微镜的功能使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。逐点扫描，形成光学切片一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能牛肺上皮细胞

展现最清晰成像细节一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展现最清晰成像细节一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能小鼠神经元细胞

高清晰成像一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能多通道同时扫描普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。激光共聚焦显微镜的功能一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能动脉内皮细胞三标记一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能多重荧光标记海马DG区一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能绿色：SYBR14染色，活精子红色：PI染色，死精子绿色：活菌红色：死菌牛精子藤黄微球菌一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能拟南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia

斑马鱼神经元系统，byAlbertPan，HarvardUniversity共聚焦绚丽图像视网膜烟花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversity一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ZOOM成像激光共聚焦显微镜的功能在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。共聚焦的优势一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ZOOM成像一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ZOOM和高分辨率扫描的极限尽量使用高数值孔径油镜！一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能多维度扫描通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度，可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立体图像。XYZ扫描XYT扫描激光共聚焦显微镜的功能一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能大鼠卵细胞的细胞骨架一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能胚胎的结构一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能单层面扫描

多层叠加切片分层叠加一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能耳蜗基底膜一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能三维图像重建一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能三维图像重建一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能三维图像重建—动态观测一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光定量分析激光共聚焦显微镜的功能使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过比对各组样品之间的荧光强度值，进行定量分析。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光定量分析随机圈取细胞，可得到所圈细胞的相对荧光强度值一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光表达量测定利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的水平差异。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦显微镜技术应用第三部分如何获得一幅好的图片一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能观察的对象

荧光（Fluorescence）荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象

通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：激发光谱—通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。发射光谱—荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。488nm525nmFITC450nm490nm400450500550600650700750800EXCITATIONandEMISSIONSPECTRA激发光谱发射光谱

TexasRed

Cy5INTENSITY[arb.units]WAVELENGTH[nm]FITCRhodamine荧光物质不同其光谱也不同一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能自发荧光：指组织细胞不经任何荧光染色便能够激发荧光。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。观察的对象

荧光（Fluorescence）外源导入荧光蛋白：利用转基因技术将荧光蛋白基因导入细胞里，让其表达融合蛋白而产生的荧光。组织和细胞中荧光的来源荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/fluorescence-microscopy-and-immunofluorescence-if/organelle-stains-for-fluorescence-imaging-selection-guide.htmlGolgiinfixedandpermeabilizedNIH3T3mousefibroblastcellswaslabeledwithgreen-fluorescentAlexaFluor®488conjugateofHPAlectin.Filamentousactinwasstainedwithred-orange-fluorescentAlexaFluor®568phalloidin.MitochondriawerelabeledwithaprimaryantibodydirectedagainstOxPhosComplexVInhibitorProteinandvisualizedusingfar-red-fluorescentAlexaFluor®680goatanti-mouseIgG.Nucleiwerestainedwithblue-fluorescentDAPI.荧光抗体或荧光染料标记细胞器或亚细胞结构一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能绿色荧光蛋白

（Green-FluorescentProtein，GFP）活体检测：由于长波能量低,细胞忍受能力强。长时间检测：荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白能力比荧光素强。容易融合：分子量较小,易与目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。可指示外源目的基因表达及沉默内源目的基因表达238个氨基酸组成。激发波长479nm发射波长508nm1962年，日本下村修（Shimomure）等首先从维多利亚水母中分离出了GFP。2008年，美国科学家钱永健、马丁·沙尔菲和下村修三人因发现GFP而获得诺贝尔化学奖。衍生物和突变体：BFP、CFP、GFP、RFP、YFP一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能ThesefusionproteinsemployarangeoffluorescentmoleculesincludingCFP,GFP,mKATE2,RFPandYFP。各类荧光蛋白作为标签（tag)融合细胞器特异蛋白指示细胞器一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。荧光探针的选择荧光探针的种类：①大分子探针②细胞器探针③核酸探针④金属离子探针⑤细胞电位和细胞内pH值探针⑥分子的特殊集团结合探针……一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光探针的选择选择的依据：根据实验目的确定需要检定的指标；确定可供选择的荧光探针的范围；考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能被激光共聚焦显微镜系统检测到一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光探针的选择—多重荧光标记原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求荧光素选择/组合核复染单标

无特殊限制。

FITC,Cy2最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外)

与自发荧光冲突时，采用TexasRed

。PI/DAPI双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必须顺序扫描)DAPI(必须顺序扫描)三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必须顺序扫描)活细胞追踪

能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞

()

显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能1.作为亚细胞定位的标记蛋白定位在哪里呢？核复染的作用一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能2.作为整体结构的标记图中共有多少个细胞？阳性蛋白的表达效率是多少？一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能荧光探针的选择—多重荧光标记原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求荧光素选择/组合核复染单标

无特殊限制。

FITC,Cy2最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外)

与自发荧光冲突时，采用TexasRed

。PI/DAPI双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必须顺序扫描)DAPI(必须顺序扫描)三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必须顺序扫描)活细胞追踪

能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞

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显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能样品前处理组织切片：切片的厚度

4-50mm

①冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。

②石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。细胞标本：

①细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。

②细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于20％；

如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的80％。

③承载细胞的器皿：petri皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。