发酵工程实验及发酵工程总结

实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验目的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。2、了解市售酸奶的生产工艺。3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。实验原理：乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：（一）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。6、发酵：发酵的温度保持在40-43℃，一般发酵时间为3-6h发酵终点的确定有两种方法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70T°。2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2h8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃9、感官指标1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。3）气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带4-6颗玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水三角瓶中，稀释至10－2，以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;③、倒培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h。⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/克。实验器材及试剂：菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿，酸奶发酵瓶（自带）实验结果：详细描述自己制作的酸奶结果：答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较，比市场所售酸奶更稠密，酸奶的香味与酸味明显，制作成功记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据，计算最终平均值。答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落，全部为杂菌菌落，因此无法统计酸奶中的菌含量同时用图片记录实验过程中各现象与结果并对图进行注释。答：制备乳酸菌时，瓶子上方留有一部分空间，并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵，但乳酸菌是兼性厌氧菌，因此在存在少量氧气的环境中，乳酸菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。思考题：乳酸菌的保藏通常为低温条件，这给运输、保藏带来很大的成本，请问可采用什么方法使乳酸菌在常温条件下有很高的存活率？答：在基因水平上对乳酸菌进行基因重组，从而获得耐高温乳酸菌。在基因库里筛选抗高温的基因并利用基因重组技术将其重组在乳酸菌基因上，对乳酸菌的基因进行修饰使其表达，以此来获得耐高温菌株。实验二枯草芽孢杆菌固态发酵及活菌数测定（5学时）实验目的：1、学习了解固态发酵原理；2、以枯草芽孢杆菌为对象，了解固态发酵的控制技术；3、掌握枯草芽孢杆菌活菌计数方法与操作。实验原理：作为抗生素的替代品，益生菌和酶制剂等的研究与开发近几年成为绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌倍受关注。作为益生菌的一种，芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直都是畜牧业科研和生产人员关注的焦点。目前芽孢杆菌多采用液体深层发酵技术，再经喷雾干燥进行生产，对设备要求高，生产工艺复杂；而固体发酵采用的原料一般是廉价的农副产品(如草粉、麸皮等)，采用的设备也较液体发酵简单，生产成本大大低于液体发酵。所以近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，以求简化生产工艺，提高产量，降低生产成本。固态发酵定义：指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，培养一种或多种微生物的生物反应过程，是以气相为连续相的生物反应过程。枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，实验室条件下利用稀释涂布培养的方法，让菌在有氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容：1、液体种子培养基配制：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，pH7.0。2、液体种子培养：每300mL三角瓶装量50mL液体种子培养基，在115℃条件下灭菌30min。降温后从斜面接一环菌苔至种子培养基。置37℃控温摇床培养。转速200r·min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24h。3、固体发酵培养基：麸皮60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:1.1。4、三角瓶固体发酵培养：每250mL三角瓶装量20-30g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30min，降温后接种量为2%(V/M：V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量)，然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48h。（二）枯草芽孢菌活菌检测①、检测培养基：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH7.0。115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;③、倒培养平板，将已经灭了菌的保持在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，待培养基凝固；从上述已稀释了1亿倍的菌悬液中取0.2ml于已凝固的培养基表面，用玻璃刮铲涂布均匀，静止10min，然后再移入培养箱中培养。④、培养条件：37℃恒温培养箱培养24～48h；⑤、培养完毕后，取出进行计数。（三）芽孢率测定:采用芽孢革兰氏染色后显微镜下观察实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：培养基成分器材：培养箱、灭菌锅，培养皿实验结果：详细描述枯草芽孢杆菌固态培养物（外观、气味、培养物状态等）：答：枯草芽孢杆菌淡黄色，中间色深，表面较平整，无光泽，边缘不整齐，形成的菌落为圆形。培养基中的枯草芽孢杆菌有腥臭味，长势良好，观察培养基，无明显染菌现象。记录活菌测定中各平行数据，计算最终平均值。答：数量稀释倍数密度（/g）第一个平板1125×1075.6×109第二个平板655×1073.25×109第三个平板225×1071.1×109平均值3.32×1093、同时用图片记录实验过程中各现象与结果，并对图进行注释。菌落成白色，菌落表面有褶皱思考题：在枯草芽孢杆菌固态生产过程中，为了防止霉菌与酵母的污染，可如何进行操作？答：加入抗真菌抑制剂实验三、淀粉糖化与酒精发酵（5学时）实验类型：综合性实验目的：1．了解酒精发酵的主要类型、工艺原理及其控制条件2．熟悉酒精生产的工艺流程、掌握酒精发酵的操作方法3.掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法4.掌握在实验室中模拟酒精发酵的工艺流程实验原理玉米粉、大米粉中可供发酵的物质主要是淀粉，而酿酒酵母由于缺乏相应的酶，所以不能直接利用淀粉进行酒精发酵，因此必须对原料进行预处理，包括蒸煮（液化）、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破坏细胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的作用，并转化为可发酵性糖，以便酵母进行酒精发酵。在无氧条件下酵母菌利用可发酵性糖转化为酒精和二氧化碳的作用，称为酒精发酵，是生产酒精及各种酒类的基础，可通过测定发酵过程中产生CO2的量和最终产物酒精的量得知酵母的发酵能力。实验内容1、原料的粉碎将玉米、大米用粉碎机粉碎，玉米淀粉含量为70%，大米淀粉含量为75%。2、蒸煮糊化称取一定量的粉碎后淀粉质原料，按一定的料水比（100g：200ml），调制淀粉乳，90-100℃条件下恒温水浴加热，淀粉乳受热后，在一定温度范围，淀粉粒开始破坏，晶体结构消失，体积膨大，粘度急剧上升，呈粘稠的糊状，即成为非结晶性的淀粉。3、糖化经蒸煮糊化后的醪液，经过淀粉酶的糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，供酵母利用。酶参考用量：淀粉乳33%，60℃，ph4.5，酶240U/g绝干淀粉，糖化时间16h。糊化醪液调整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶（120U/g）、糖化酶（120U/g），60℃恒温下不断搅拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化4、发酵（1）干酵母活化将干酵母按1:20的比例投放于37℃的温水中复水20min。目的：恢复酵母细胞的正常功能。（2）淀粉醪液糖化后，取400ml上清液于洁净的大可乐瓶中，加相同体积的水稀释，加入活化好的酵母种液5ml，混匀，28度培养箱中静止培养36h左右。5、二氧化碳生成的检验（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出；（2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；6、二氧化碳生产量的测定（1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1;（2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2；（3）二氧化碳生成量=W1-W27、酒精生成的检验（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味；（2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；（3）再加入1%K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色说明有酒精产生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3实验器材及试剂：菌种：活性干酵母试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶溶液：10%H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机实验结果：详细记录实验过程中各参数及数据。淀粉淀粉酶CaCl2糖化酶100g10g0.17g2.5g2.对实验结果的判断与分析。答:1二氧化碳生成的检验培养约48h后，观察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清浓度较稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡2酒精生成的检验打开瓶塞，闻到有浓重酒精气味。取发酵液5ml,加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。思考题：现有3株不同来源的酒精酵母，请设计与本实验操作不同的实验，判断哪株酵母发酵酒精能力最强？答：按实验步骤配制等量的三组醪液，加入等量糖化酶进行糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，向三组糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同来源的酒精酵母种液，相同条件下培养一段时间，分别测定三组实验产生的CO2的质量，进行比较。产CO2越多表示发酵酒精能力越强。实验四黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应（5学时）实验目的：1、了解黑曲霉固体发酵产酶情况2、掌握微生物固体发酵操作技术3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法实验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。实验内容1、黑曲霉菌种活化（1）配制PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于PDA斜面，28℃培养5-7天，斜面上长满孢子。2、配制发酵培养基：15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5%(NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌匀，装瓶；3、灭菌：121℃灭菌30min，冷却至室温。4、黑曲霉孢子悬浮液制备已培养好的黑曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。5、接种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。6、提取粗酶液向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液。7、酶活性测定（1）配制1%CMC底物平板：配方：1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂，100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。（2）打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。（3）加样：往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。（4）培养（反应）：将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱，放置20小时左右。（5）观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。实验器材及试剂：菌种：黑曲霉试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC）器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述；答：固体培养基发酵前：培养基颜色较浅，各成分（麸皮、稻草）新鲜，粘度大成团状固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体，培养基营养成分被利用，体积缩小仔细观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。现象：纸片周围出现浅浅的水解圈，打孔培养基未出现水解圈，纸片直径2.5cm，水解圈3cm，直径比5:6思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？目前对纤维素降解有哪些研究进展？答：要想最大限度的利用纤维素，可从两个方面入手。一是通过生产高性能纤维素酶的方法，二是找到蕴含能量较高的纤维素。而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的获取，而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的新菌株。目前在纤维素的降解方面，微生物的研究较多，降解纤维素的真菌有很多，如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝，

菌丝具有很强的穿透能力，能穿透植物角质层的阻碍，紧紧依附和穿插在纤维物质上，

增大降解酶与纤维物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌。目前，木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属。实验五甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6学时）实验目的：了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制与固体发酵产酶进行比较分析实验原理甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成。当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。在纺织印染方面，利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。实验内容菌种活化（1）配制LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面，28℃培养2天。配制产酶培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉30g/L，以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121℃灭菌20分钟；菌悬液的制备已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。接种用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养72h。粗酶液提取：3000rpm离心收集得到粗酶液酶解底物分析：准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保温往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液1ml，另一个加入1ml蒸馏水（做空白对照）。以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g酶解反应30-60min，期间观察反应现象。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶实验结果：仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；答：①发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。②经过三天的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状仔细观察底物水解前后的现象。答：对照组：魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，实验难以继续。实验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。思考题：以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。答：原理：样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。方法：别向2支试管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保温5min。在其中一支试管中加入200μL稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置于50℃水浴中准确保温5min。加入3.0mLDNS试剂至两支试管中，搅拌均匀。在另一支试管（空白管）中加入200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。于540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。实验六从土壤中分离筛选产抗生素放线菌及抗菌谱分析实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。3、掌握微生物的基本操作。实验原理：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌（本实验加入重铬酸钾150㎎／L），霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，挑取纯菌落进行抗菌谱分析，指示菌为大肠杆菌（G-）和枯草芽孢杆菌（G+）。实验内容1、高氏一号培养基的制备可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4•3H2O0.5g，MgSO4•7H2O0.5g，FeSO4•7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟（实验中所用无菌器具均在此时灭菌）。2、土壤取样及其悬液梯度稀释选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。3、称土样10g于盛有90mL无菌水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-1浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管4支，编号10-2、10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管3~4次，使与9ml水混匀，即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。4、稀释倒平板法分离土壤中放线菌取3支1毫升移液管分别从10-3、10-4、10-5菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-3、10-4、10-5的培养皿内，每一梯度两个平板。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右）培养一周，每天观察培养基表面有无微生物菌落。将平皿上的放线菌菌落挑取在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。5、抗菌谱测定：（1）配制LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。灭菌后倒平板。（2）将摇床培养12h的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别涂布于固态LB培养基，静置10min。（3）挖取一个放线菌菌落（含培养基），倒置于平板分区的中央，培养一天后，观察并测量抑菌圈大小。实验器材及试剂：菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌试剂：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、酒精、土壤器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、天平、三角瓶、试管、棉塞、涂布棒、接种环实验结果：1描述分离到的放线菌培养特征；放线菌表面光滑，颜色各异，黄，黑，褐，白，橙色，菌落较小。2观察并测量对指示菌的抑菌圈大小。枯草芽胞杆菌没有抑菌圈，大肠杆菌基本都有抑菌圈，菌圈直径0.8cm，抑菌圈直径小的0.93cm，大的1.3cm。思考题：以某一抗生素为例，描述其工业生产操作。1.制备孢子2.斜面接种3.接种到大米上，产生米孢子4.将米孢子接种到一级种子罐5.接种到二级种子罐6.接种到发酵罐7.预处理罐8.过滤器9.萃取器10.蒸发器11.结晶器12.工业盐1绪论1-1何谓发酵？生物化学和工业上的发酵有何不同？生物化学意义上的发酵是指细胞在无氧条件下，分解葡萄糖或有机物产生能量的过程。工业意义上的发酵是泛指利用培养细胞（包括动物、植物和微生物）获得产物的任何有氧或无氧的过程。1-2何谓发酵工程？其主要内容是什么？请简述其与生物技术的关系。发酵工程是利用生物体为工业化生产服务的一门工程技术，即利用生物体的生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行酶加工（生物反应过程），获得产品的工程化技术。它是研究生物技术产业化的一门学科，其主体包括生物反应工程和产品提取、精制的下游工程。主要研究内容：1）优良菌种的选育；2）合适的生物反应工程包括生物反应过程的优化、反应器的选择和下游工程生物技术是应用自然科学和工程学的原理，依靠生物催化剂（酶或细胞）的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。它包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程等五大工程。生物技术的核心是基因工程，但又离不开发酵工程。发酵工程是基因工程和酶工程的表达，即大部分生物工程的产品均要通过发酵工程来完成。所以说，发酵工程在生物工程中是最关键的过程。现代发酵工程处于生物技术的中心地位，绝大多数生物技术的目标都是通过发酵工程来实现的。因此生物技术的主要应用领域往往就是发酵工程的研究对象。1-3请简述发酵工程的发展史。1）基因工程出现之前的时代（1982年前）；1859年发现发酵原理、设计了便于灭菌的密闭式发酵罐；1929,1940年发现和分离出青霉素，青霉素发酵、将通气搅拌引入发酵工业；1956年谷氨酸等氨基酸、核苷酸等发酵成功、代谢控制育种理论的建立；60年代采用烷烃、乙酸、天然气等为原料的石油发酵；2）基因工程出现后的时代（1982年后）。80年代随着基因工程技术的发展，人们可定向选育高产菌株；1991年综述代谢工程，在对细胞内代谢网络系统分析的基础上开始运用基因工程技术改造细胞代谢途径，以改进细胞性能或提高产物生产能力。组学的发展……系统工程和合成生物学……1-4何谓初级代谢和次生代谢？举例说明初级代谢产物和次生代谢产物。初级代谢：微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程称为初级代谢。常见的初级代谢产物有：乙醇、氨基酸、呈味核苷酸、有机酸、多羟基化合物、多糖（黄原胶、结冷胶）、糖类和维生素。次生代谢：是相对于初级代谢而言的一个概念。它是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无必要功能的物质的过程。次生代谢产物大都是分子结构复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、酶和毒素。3灭菌3-1灭菌的方法有哪几种？化学药剂灭菌（过氧乙酸、次氯酸钠、二氧化氯、甲醛、过氧乙酸、环氧乙烷……）射线灭菌（紫外线、高能电磁波、放射性物质产生的高能粒子）干热灭菌（160°C，1h；主要由于氧化作用而死亡：微波加热灭菌、烘箱加热灭菌）湿热灭菌（120°C，30min；利用饱和蒸汽灭菌）过滤除菌（空气除菌、料液的过滤除菌）3-2何谓空消和实消？各自操作如何？空消：培养基采用连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前直接通蒸汽进行空罐灭菌（进汽→关阀升压→保压30min→降压后通入无菌空气→冷却）；实消：实罐灭菌，即分批灭菌，将配制好的培养基放在发酵罐或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用装置一起进行灭菌。3-3连续灭菌流程有哪几种？各自的特点是什么？连消塔—喷淋冷却连续灭菌流程：由连消泵、连消塔、维持罐和喷淋冷却器组成薄板换热器连续灭菌流程：由3个薄板换热器、维持管组成，节约了蒸汽和冷却水喷射加热连续灭菌流程：由喷射加热器、维持管、膨胀阀和真空冷却器组成3-4简述发酵用无菌空气的质量标准。1. 连续提供一定流量的压缩空气，VVM=0.1-2.0；2. 空气的压力一般为0.2-0.4Mpa;3. 进入过滤器前空气的相对湿度≤70%；4. 进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30°C;5. 过滤后空气的无菌程度为10-3。3-5空气过滤除菌流程一般包括哪几部分？各自的作用是什么？粗过滤器【去除大颗粒尘埃，粗过滤器分为布袋过滤器、油浴洗涤和水雾除尘器3种】→空气压缩机【供给能量】→贮罐【缓冲排气压力，稳定气压】→油水分离器【去除压缩空气中的大颗粒油水雾】→空气冷却器【冷却压缩空气，使其析出水汽】→水分离器【分离压缩空气的水汽】→加热器【除水后相对湿度一般为100%，加热以降至50-60%】→总过滤器【除菌，给全厂提供无菌空气】→分过滤器【进一步除菌，保证各发酵罐空气无菌】3-6某生物制药厂采用空气冷却流程一制备无菌空气，当地空气相对湿度60%。空气进入总过滤器时的状态是：相对湿度60%、压力0.4MPa，温度35°C。通过计算确定，当地气温最高不能高于多少？（10、12、15、20、35°C的饱和水蒸汽压力分别为1228、1418、1705、2339、5615Pa）P1=0.1MPa，P2=0.4MPa，ϕ1=ϕ2，4Pb1=Pb2，根据饱和蒸气压数据，得t<12°C3-7深层过滤除菌的机理是什么？请简述其各自的作用机制。深层过滤介质的孔隙大于微生物。利用颗粒的惯性冲击、布朗运动、颗粒与介质的静电引力、重力沉降等作用将细菌拦截在介质中进行除菌。一般认为惯性、拦截和布朗运动的作用较大，而重力和静电引力的作用较小。惯性冲击作用：当灰尘颗粒随气流前进遇到过滤介质时，气流受阻而改变方向，而颗粒因惯性作用仍沿直线向前运动，与纤维碰撞摩擦而吸附在纤维表面，以此拦截颗粒。拦截滞留作用：在空气流速较小时，微粒的流动与空气流线相似，受纤维所阻时，改变方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞流区。而滞流区的空气流速更慢，进到滞流区的微粒慢慢靠近和接触纤维，从而被粘附滞留。布朗运动：在很小气速和较小的纤维间隙时，则布朗扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触机会，从而将微粒截留住。重力沉降作用：重力沉降作用是一个稳定的分离作用。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就很容易沉降。大颗粒比小颗粒更易沉降；对小颗粒来说，只有气速很慢时才起作用。一般它与拦截作用相配合，即在纤维的边界滞流区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。静电作用：干空气与非导体的物质（如过滤介质纤维）间的相对运动摩擦，会产生诱导电荷。悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子20%带正电荷，15%带负电荷。这些带电的微粒就会受异性电荷的物体吸引而沉降。3-8空气过滤除菌的设备主要有哪些？各自的作用是什么？粗过滤器【去除大颗粒尘埃，粗过滤器分为布袋过滤器、油浴洗涤和水雾除尘器3种】→空气压缩机【供给能量】→贮罐【缓冲排气压力，稳定气压】→油水分离器【去除压缩空气中的大颗粒油水雾】→空气冷却器【冷却压缩空气，使其析出水汽】→水分离器【分离压缩空气的水汽】→加热器【除水后相对湿度一般为100%，加热以降至50-60%】→总过滤器【除菌，给全厂提供无菌空气】→分过滤器【进一步除菌，保证各发酵罐空气无菌】4发酵技术4-1发酵培养技术有哪些？各种技术的特点是什么？分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵、连续发酵分批发酵：发酵液体积恒定，发酵液中物质浓度随时间而变化；分批补料发酵：在分批发酵过程中，间隙或连续的补加新鲜培养基的培养技术。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在不断增加；半连续发酵：补料分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液（行业中称为带放）；连续发酵：补料的同时放走发酵液，发酵液体积不变。4-2 请简述分批培养过程微生物细胞的典型生长曲线及其每个阶段的特点。停滞期：刚接种后的一段时间内，因菌种对新的生长环境有一适应过程，细胞数目和菌量不变的过程加速期：通常很短，比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。对数期：细胞已完全适应其周围环境后，便进入恒定的对数或指数生长期。减速期：随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时虽然细胞量仍旧在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化。平衡期：实际上是一种生长和死亡的动态平衡，µ【比生长速率】=α【比死亡速率】，净生长速率等于零。由于此时菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此时大量合成，菌的形态也发生较大的变化（如菌体分化，染色变浅，形成空胞等）。死亡期：当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期。这时α＞µ，生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于X0（初始浓度）。4-3简述微生物产物合成与细胞生长之间的关系及其工艺控制策略。生长耦联型：微生物的生长、碳水化合物的降解代谢和产物的形成几乎是平行进行的，营养期和分化期彼此不分开，也即代谢产物的生成和细胞的生长是同步的和完全耦联的【策略：延长发酵周期有利于产物合成】；非生长耦联型：产物一般不是直接或间接来自微生物的产能降解代谢，而是通过两用代谢途径合成的，所以产物的生产与细胞生长无直接关系【策略：如次生代谢产物，则以缩短菌体的对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长生产期，以提高产量】；混合生长耦联型：产物间接的与微生物的初级产能代谢途径相关，这类反应产物的生产与细胞的生长仅有间接关系【策略：根据其耦联程度而灵活调节】。4-4名词解释：比生长速率：指单位菌体（每克菌体）单位时间内（一小时）增加的菌体量基质比消耗速率：指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生成速率：指每克菌体在一个小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速度或能力。对基质的细胞得率系数【YG】：指每消耗1g（或mol）基质所产生的菌体重。对基质的产物得率系数【YP】：指每消耗1g（或mol）基质所合成的产物质量。基质消耗速率方程：。X是当前菌浓度，m是细菌维持生命活动的消耗系数Luedeking-Piret方程：基本形式为，是描述产物形成动力学中混合生长耦联型的模型。5发酵工艺5-1培养基的种类有哪些？前体、促进剂和抑制剂有何不同？何谓碳分解代谢物阻遏、快速利用氮源、生理酸性和碱性氮源？培养基按纯度分为合成培养基【成分完全已知】和复合培养基【一些成分不完全明确】；按状态分固体培养基、半固体培养基、液体培养基；按用途分孢子培养基【繁殖孢子用】、种子培养基【培育种子（用于生产的初始菌）用】、发酵培养基【生产用】。前体是指加入后能直接在生物合成中结合到产物分子中而其自身的结构并没有多大变化，但产物的产量却有较大提高的物质【如VB12的氯化钴】。促进剂是指既不是营养物又不是前体但能提高产量的物质【如促进分散的表面活性剂】。抑制剂是指在发酵过程中加入某些物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而使所需产物或正常代谢的中间产物得以积累【甘油发酵中添加亚硫酸氢钠】。碳分解代谢物阻遏是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源（通常为葡萄糖），且该碳源的代谢产物会抑制其它非速效碳源代谢相关的基因表达和蛋白活性，从而影响非速效碳源利用的现象。快速利用氮源即无机氮源，包括氨水、硝酸盐、铵盐。无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性氮源，代谢后产生碱性物质的无机氮源（NO3-）称为生理碱性氮源5-2最适pH与微生物生长和产物形成的相互关系有哪几种？如何确定某一微生物发酵的生长和产物形成的最佳pH？又如何控制其pH？最适pH与微生物生长和产物形成的相互关系有：µ、QP都有一个相同的较宽的最适pH范围；µ(或QP)的最适pH范围一个很窄、一个很宽；µ和QP对pH都很敏感，但最适pH又相同；µ和QP对pH都很敏感，但最适pH却不相同。【µ：菌体生长；QP：产物合成】菌体生长和产物合成的最适pH根据实验来确定。发酵过程pH的控制方法：1）流加酸：HCl；2）补加氨水或尿素：3）碳酸钙：中和产生CO24）补料控制pH5-3何谓呼吸强度、耗氧速率、临界溶氧浓度？呼吸强度：表示微生物的相对需氧量，指单位重量干菌体在单位时间内消耗的氧量；耗氧速率：是指单位体积培养液在单位时间内细胞摄取（或消耗）氧的量，也称摄氧速率；临界溶氧浓度：各种细胞对溶解氧浓度有一个最低要求，即发酵过程不需要使溶氧浓度达到或接近饱和值，只是超过此一氧浓度即可。此时溶氧浓度就称为“临界溶氧浓度”。5-4 氧传递速率方程是什么？氧传递阻力主要是什么？影响氧传递的因素有哪些？请简述搅拌与通风影响溶氧的的机制。请举出几种氧载体。主要传递阻力是气液相间氧传递过程；影响氧传递的因素有溶氧系数(KLa)和传递推动力(C*-CL)；搅拌能够显著提高溶氧系数，具体表现为：1) 搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，a和气液的接触时间增大；2) 搅拌使液体作涡流运动，延长了气泡的运动路线，即增加了气液的接触时间；3) 搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力；4) 搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使推动力均一。氧载体包括：液态烷烃、正十二烷、正十六烷、全氟化碳、油酸、硅油、豆油。5-5发酵过程中泡沫是如何形成的？如何控制泡沫？常用的消泡剂有哪些？请具体写出几个代表性消泡剂。在微生物深层培养过程中由于通气和搅拌、代谢气体的逸出以及培养基中糖、蛋白质、代谢物等稳定泡沫的表面活性物质的存在，使发酵液中产生一定数量的泡沫。控制泡沫有两种方法：机械消泡：在搅拌轴上方安装消沫浆，泡沫借旋风离心场而消泡。化学消泡：利用消泡剂以降低液膜的机械强度或降低液膜的表面粘度进行消泡。6生物反应器6-1何谓生物反应器？一个良好的生物反应器应具备什么条件？生物反应器指提供适宜细胞生长和产物形成的各种条件，促进细胞的新陈代谢，在低消耗下获得高产量的一种反应设备。一个优良的生物反应器应具备的条件：1) 结构简单；2) 不易染菌；3) 良好的液体混合性能；4) 较高的传质传热速率；5) 单位时间单位体积的生产能力高；6) 同时还应具有配套而又可靠的检测和控制仪表。6-2常见的通风发酵罐有哪些？分别描述它们各自的结构特征及优缺点。1.通用式发酵罐【既有机械搅拌装置，又有压缩空气分布装置】{技术成熟，通用性好，性能稳定；结构复杂，能耗大，造价高}2.机械搅拌式自吸式发酵罐【利用机械搅拌的高速旋转而吸入空气】{省去了压缩机；吸程短，易染菌，剪切损伤大}3.气升式发酵罐【是指利用空气的提升作用而使发酵液循环，没有机械搅拌】{结构简单，造价低，避免染菌，能耗低，供氧好，无搅拌剪切；不适宜高粘度或固含量大的发酵}4.喷射自吸式发酵罐【利用喷射吸气装置吸入空气而进行气液混合】{三相混合与分散良好，溶氧速率高，能耗低，无需提供压缩空气；较易染菌}6-3通用式发酵罐与气升式发酵罐有何区别？两者的主要区别在于：1) 气升罐功率消耗比通用式罐低；2) 总功率相同时，气升罐的氧传递速率比通用式罐高；3) 气升罐比通用式罐结构简单，且没有机械轴封；4) 气升罐对细胞的剪切作用比通用式罐要小得多。6-4厌氧菌培养的特点是什么？酒精发酵罐为什么没有机械搅拌装置？厌氧菌的氧化与有机物的还原耦合，因而形成较少的ATP，其细胞得率比需氧菌少许多。酒精发酵罐属于厌氧发酵罐，发酵过程不需要供氧，且产生的CO2气体可以起到类似气升式罐一般的混合效果，因此没有机械搅拌装置。6-5什么是固体发酵？其有何优缺点？请简述影响固体发酵的因素。几种固体发酵罐有何共同特点？所谓固体发酵是指，在湿含量低于90%或不含或很少自由水的固体或含固体颗粒培养基中的发酵。优点：产率高；抗污染强；装料系数大；部分微生物生长更好；可以以加工业残渣为原料，降低生产成本；提取产物所需的溶剂少；发酵废物的处理简单，可直接干燥作为动物饲料。缺点：物料搅拌难，混合不均，控制不易；传热性质差，温度控制难；发酵参数难以检测；不太适合细菌生长；研究不透彻，目前往往依靠经验。影响固体发酵的因素主要有合适菌株的筛选、最适基质的确定和控制参数的优化。共同特点是都严格控制了固体发酵中氧的传递、温度和基质的湿含量。7基因工程菌的培养7-1影响工程菌不稳定的因素有哪些？培养基的组成：质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达；培养温度：通常低温有利于重组质粒的稳定遗传；菌体的比生长速率：如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失；控制基因的过量表达：外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。7-2何谓高密度培养？重组大肠杆菌的高密度培养的关键和核心是什么？其培养技术有哪几种？高密度培养是指提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案，合理流加碳源降低‘葡萄糖效应’常见的流加技术：恒速流加、变速流加、指数流加、反馈流加。7-3请简述毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的原理。何谓“三段法”？重组毕赤酵母高密度培养时应注意哪些问题？毕赤酵母为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶（AOX）。生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。因此，可利用醇氧化酶基因（AOX1）作为强启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白