发光的大肠杆菌课件

发光的大肠杆菌朱静宇张明石卉.1制备感受态细胞质粒扩增质粒酶切目的基因序列扩增连接转化实验方案概述.2材料大肠杆菌少量PET28质粒（既为原核质粒又为真核质粒）显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒）.3制备大肠杆菌感受态细胞

挑取E.coil单菌落接种至2mlSOC培养液，37℃摇床过夜。挑取0.5—1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直至A600达到0.6，取出水浴10min4℃4000rpm/min10min.同时冰浴配置TB溶液。弃上清，倒置离心管于滤纸上1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB溶液冰浴10-15min。4℃4000rpm/min10min去上清，沉淀重悬于4mlTB中，冰浴10min加入280uLDMSO,混合均匀，冰浴10min分装于EP管中，-80℃或液氮保存检测感受态细胞的质量（阴性对照）.4质粒扩增pet28的质粒扩增PEGFP-N3质粒扩增摇菌转化提质粒.5转化

取100ul感受态细胞于冰浴上融化加入1ul

pet28质粒和1ulPEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴30min将菌液放入42°C水浴热激90s，立即放入冰浴中2min将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板，平板于37°C倒置培养过夜。同时进行阳性和阴性对照.6摇菌+提质粒

将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37°C摇床中rpm/min,摇菌16小时左右运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提用浓度为1%的胶，120V

20min，用10000的marker做对照验证测浓度.7质粒的酶切寻找pet28和pegfp-n3的酶切位点.8质粒的酶切（两个质粒同时酶切）确定的酶切位点：EcorR

I、XbaI内切酶：Not

I、BamHI内切酶Buffer：cutsmart37℃温育4hours未酶切的质粒作对照，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果纯化.9010203040506设计引物PEGFP-N3目的基因扩增PCR电泳胶回收纯化测序.10PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物PEGFPN5’

5'TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3'

PEGFPN3’

5’GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3’Primer2Tm68.5°CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient181100.0l/(mol˙cm)

Primer#1Tm57.6°CMolecularweight6863.5g/molExtinctioncoeficient229700.0l/(mol˙cm)SXJ

.11PCR体系premix体系TakaRaTaqdNTPmixturePCRbufferPEGFP-N3<100ngPrimer10.2-1.0uMPrimer20.2-1.0uMddH2O补足50uLPCR反应条件95℃3min98℃10s60℃30s72℃1min72℃5min4℃∞循环35次.12020103加入样品与buffer混匀，短暂离心孵育22℃

3h连接.130102030405质粒的转化感受态细胞冰浴融化加入质粒，混匀，冰浴菌液热激90s后冰浴2min加SOD，37℃摇菌2000rpm/m