SNT5668-2023 水禽圆环病毒感染检疫技术规范

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标T水禽圆环病毒感染检疫技术规9发 1实中华人民共和国海关总署发布T 本文件按标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位中华人民共和国福州海关福建省农业科学院畜牧兽医研究所厦门市翰均科检测科技有限公司中华人民共和国石家庄海关。本文件主要起草人郑腾傅光华张体银施少华张志灯黄瑜王武军程龙飞王建昌谢向机、陈翠腾黄素文万春和傅秋玲姜焱陈红梅刘荣昌陈珍江南松。ⅠT水禽圆环病毒感染检疫技术规范围本文件规定了水禽圆环病毒感染的临床诊断聚合酶链式反应检测和实时荧光聚合酶链式反应检测要求。本文件适用于水禽圆环病毒感染鸭圆环病毒感染和鹅圆环病毒感染的监测检疫和鉴定规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义缩略语下列缩略语适用于本文件每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数)DNA:脱氧核糖核酸)三磷酸脱氧核苷酸)鸭圆环病毒)溴化乙锭m)鹅圆环病毒)聚合酶链式反疫病概述水禽圆环病毒感染是近年来倍受关注的新发现传染病之一该病流行十分广泛宿主谱广不同品种不同日龄的水禽均有报道以生长迟缓羽毛紊乱体况消瘦为主要临床特征。水禽圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属基因组为单链环状主要包括鸭圆环病毒和鹅圆环病毒。该病毒主要侵害水禽的淋巴网状内皮组织引起淋巴器官特别是法氏囊淋巴细胞减少免疫力下降导致宿主对其他病原如大肠杆菌巴氏杆菌或禽流感鸭甲肝病毒及水禽细小病毒等二次感染的易感性增加影响其他疫病病原疫苗的免疫效果V最早于9年在发病鹅中被发现V于3年首次在患病鸭中被发现。我国自5年和8年首次分别报道了1TGoCVDuCV在水禽中出现以后各地饲养的水禽均陆续现感染报道。GoCV核酸阳性率达%%%%%的是目前已有在患病鹅中检测DuCV的报道说明两种水禽圆环病毒还存在交叉感染现象。临床诊断临床症状感染圆环病毒的水禽可以出现以下症状水禽群体内个体间生长参差不齐感染水禽体况消瘦体重与同日龄未感染健康水禽差异明显;羽毛杂乱易脱落严重的出现背脊或翅尖羽毛完全脱落病理变化剖检变化水禽感染圆环病毒一周以后主要免疫器官开始出现以下变化胸腺出血或萎缩法氏囊萎缩脾脏萎缩组织学变化组织学变化如下法氏囊淋巴滤泡结构消失淋巴细胞显著减少胸腺淋巴细胞显著减少细胞核出现碎裂和空泡化脾脏红髓和白髓边界消失白髓淋巴细胞减少初步诊断当水禽出现以上临床症状结合病理变化可初步诊断为疑似水禽圆环病毒感染需要进一步进行实验室检测。仪器和设备台式冷冻离心机转速不低于微量移液器组织匀浆器电泳仪电泳槽紫外凝胶成像系统22T试剂引物和探针水2中二级水的规格K0%十二烷基磺酸钠As饱和苯酚。酚∶三氯甲烷∶异戊醇3L的醋酸钠溶液配制方法按无水乙醇%溴化乙锭溶液配制方法按琼脂糖凝胶配制方法按DNA分子量标准物0×加样缓冲液;;引物序列中的简并碱基Y表示C或T,W表示A或T,M表示A或CR表示A或1与R1用于检扩增条带为p大小的基因片段1R2用于检扩增条带为p大小的基因片段。各引物的工作浓度均为保存于-20℃备用。荧光PCR引物和探针检测鸭圆环病毒的SYBRⅠ荧光PCR检测引物:上游GGCGAAGAGCGGCAA;扩增片段约用水溶解至L后保存于-20℃备用检测鹅圆环病毒荧光PCR检测引物和探针;;引物序列中的简并碱基RA或p其5末端标记荧光报告基AM3末端记荧光淬灭基扩增片段约用水溶解至L后保存于-20℃备用样品的采集与处理对生长不良羽毛紊乱体况消瘦或发病的水禽的要求无菌采集水禽的法氏囊脾脏等器官合并进行检测。采集的器官剪碎后与磷酸盐缓冲液按按体积比1∶5的比例制成组织匀浆液反复冻融3次n离心0取上清用于DNA抽提或置-20℃条件下冻存备用。对被检水禽以棉拭子分别采集咽喉和泄殖腔分泌物合并进行检测。以无菌棉拭子在咽喉或泄殖腔内来回刮取3次后合并放置于2L含抗生素的磷酸盐缓冲液中用于A抽提或置0℃冻3T存备用若采集的样品需放置6h后再进行处理应先置-20条件下保存备用应在冷冻状态下运输水禽圆环病毒聚合酶链式反应设立对照分别以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照取540μL匀浆上清液或棉拭子浸出液加入60μL10K5充分混匀6℃水浴2hsn取离心后上清液加入等体积酚三氯甲烷异戊醇颠倒混匀静置5后在4℃下n离心15重复3步骤1次。取离心后的上清液加入0体积的3L的醋酸钠溶液H为5倍体积的无水乙醇颠倒混匀20℃沉淀2h。n2次,瞬时离心后吸尽残余液体室温静置5扩增或保存于-20℃条件下。注:DNA提取也能选用等效的商品化试剂盒在2mLPCR反应管中按表1配制反应体系加样宜按空白对照阴性对照待检样品阳性对照的次序分别加入模板充分混匀。表1水禽圆环病毒PCR反应体系组分加样量终浓×q401025)1引物引物引物水—2—4T混匀后瞬时离心使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行5℃预热5n后按以下循环参数循环:940302135次2延伸8反应结束后保存于4℃。琼脂糖凝胶电泳分别取待检样品阴性对照样品阳性对照样品和空白对照样品各5μLPCR产物与L的×加样缓冲液混合均匀分别加入%琼脂糖凝胶板的样孔中同时在另一样孔中加5μLDNA分子量标准物以5m的电压电泳30n后经紫外凝胶成像系统观察结果。凝胶成像分析和测序使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果经核酸扩增电泳后如出现7p或大小的扩增条带应对其切胶回收后进行测序也可直接送PCR产物进行测序参考序列见附B1和。结果判定试验成立条件当阳性对照样品中V样品出现7p大小的扩增条带见附录C电泳图2号泳道V样品出现p大小的扩增条带见附录C电泳图3号泳道空白对照样品和阴性对照样品均无特异性扩增条带见附录C电泳图1号4号泳道本次试验结果有效。待检样品结果判定当待检样品出现p左右特异性条带参见附录C电泳图7号泳道所获扩增产物与参考序列见同源性达到0%以上可判样品GoCV核酸阳性。当待检样品出现p左右特异性条带见附录C电泳图56号泳道所获扩增产物与参考序列见同源性达到80以上可判样品为DuCV核酸阳性。无特异性扩增条带见附录C电泳图4号泳道则判样品为水禽圆环病毒核酸阴性鸭圆环病毒实时荧光设立对照以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照同反应体系在2mLPCR反应管中按表2配制反应体系加样宜按空白对照阴性对照待检样品阳性对照的次序分别加入模板充分混匀。5T表2鸭圆环病毒实时荧光PCR反应体系组分加样量终浓水—1—反应程序Ⅰ第二阶段50个循环荧光信号的收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行以获得样本的扩增动力学曲线。℃℃5号得出扩增产物的熔解曲线。结果判断综合分析仪器给出的各项结果基线以仪器给出的默认值作为参考阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准具体根据仪器噪声情况进行调整选择M通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线而且t值在扩增产物的A熔解温度Tm=±℃时出现单一的特异性峰阴性对照和空白对照无扩增曲线而且值8或无值二者均成立才可判定试验成立检验样Ct值且在扩增产DNA熔解温度Tm)℃时出现单一的特异性峰并且曲线有明显的对数增长期DuCV核酸阳性检验样5<t≤38时Tm=℃出现单一的特异性峰重复一次如果Ct值仍然并且曲线有明显的对数增长期DuCV核酸阳性否则报DuCV核酸阴性样本没tt>38时报告未检出鹅圆环病毒实时荧光设立对照以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照同反应体系在2mLPCR反应管中按表3配制反应体系加样宜按空白对照阴性对照待检样品阳性6T照的次序分别加入模板充分混匀表3鹅圆环病毒实时荧光PCR反应体系组分加样量终浓×)水—1—反应程序将已加样的PCR反应管短暂离心后放PCR仪扩增反应条件设定5预变性2之后95变性5退火收集荧光共5个循环。同时设阳性阴性对照和空白对照结果判断综合分析仪器给出的各项结果基线以仪器给出的默认值作为参考阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准具体根据仪器噪声情况进行调整选择M通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线而且值阴性对照和空白对照无扩增曲线而且t值0Ct值二者均成立才可判定试验成立50然并且曲线有明显的对数增长期GoCV核酸阳性否则GoCV核酸阴性样本Ct值0综合判定临床判定为疑似病例经R扩增出现p左右特异性条带且经序列分析证明所获扩增产物与参考序列见同源性达到%以上的或实时荧光R检测呈阳性的可判定为V感染。临床判定为疑似病例经PCR扩增出现p左右特异性条带且经序列分析证明所获扩增产物与参考序列见同源性达到0%以上或实时荧光PCR检测呈阳性的DuCV感染。临床判定为疑似病例经PCR扩增出现p和p左右特异性条带且经序列分析证明所获扩增产物分别与参考序列见同源性达到90以上的或实时荧光PCR检测呈阳性的以及与参考序列见同源性达到0%以上或实时荧光PCR检测呈阳性的可判定为DuCVGoCV共感染被检水禽虽没有明显的临床症状和剖检变化但病原检测符合1中病原检测判定标准可判样品为V感染病原检测符合2中病原检测判定标准可判样品为V感染。7T附录A规范性)试剂的配制%S0g10L08酸调节pH至再加水定容至1000室温保存备用。3L的醋酸钠溶液称取8gOc·H2O加入40mL搅拌溶解冰醋酸调pH水定容经4Pa高压灭菌30n后常温保存备用%溴化乙锭溶液配制5L乙二铵四乙酸二钠溶液称取二水乙二铵四乙酸二1g溶解于适量水中混匀后10氢氧化钠溶pH最后加水至mL羟基甲基氨基甲烷 冰乙 15L乙二铵四乙酸二钠溶液H 用时用水稀释0倍后使用%琼脂糖凝胶g0℃0加溴化乙锭溶液5μL,摇匀后倒入制胶板中待完全凝固后取下加样梳备用。×聚蔗 溴酚 8T二甲苯 至1L磷酸盐缓冲液 24H2O 54