药分三部分高效液相色谱

高效液相色谱

Highperformanceliquidchromatography,HPLC基本概念基本分类或模式HPLC的特点基本组成基本内容

HPLC液相色谱流程图PUMPDetectorW泵分离柱检测器进样阀采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入色谱柱进行分离测定的色谱方法。适用对象：高沸点、热不稳定有机及生化样品一、概述分析对象流动相差别GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%惰性气体HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80%液体，种类较多，选择余地广HPLC与GC区别一、概述HPLC&经典LC参数经典HPLC内径,cm1-5~0.4长度，cm50-10015-30填料粒度，um150-2003-7操作压力,atm1-1050-200分离时间0.5h-day~10

三高

一广

一快由于液体与气体性质的以下差异：溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小105倍左右液体粘度比气体约大102倍液体表明张力比气体大104倍左右液体密度比气体约大103倍液体不可压缩二、影响分离的因素二、影响分离因素H=A+B/u+Cuλ↓球形固定相，高压、匀浆装柱法dp↓选粒径小的化学键合相C↓

选粘度小、低流速的流动相最佳线速度大内径柱的优势柱外效应又称柱外谱带扩展，是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的因素。是指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死空间。主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生,尽可能地减小柱外效应也是HPLC仪器制造技术革新的不断追求实验表明进样阀引起的柱效增加效果非常显著,柱外死体积减小后柱效增加134倍、分离度提高116倍

2柱外＝2进样+

2连接管+

2接头+

2检测池+

2其它中心进样池体积匹配柱外效应标志？比例因子X1/X2=(D1/D2)2D-columndiameterXstandsforflowrate,

thevolumeofflowcell流动相为有机相流动相为缓冲溶液分析对象不同分离机制：疏溶剂理论等固定相：非极性键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱)流动相：极性流动相 如:甲醇-水或乙腈-水或四氢呋喃－水样品极性与k的关系:极性↑，保留时间↓应用范围：非极性--中等极性组分(80%)反相色谱(RP-HPLC)反相色谱RPLC固定液极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别固定相：极性固定相如氰基或氨基流动相：非极性溶剂（如正己烷）+极性调节剂（乙醇、四氢呋喃）流动相极性与k的关系：

流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓结构相近组分，极性大的组分后出柱应用范围：极性组分(20%)正相键合相色谱法(NP-HPLC)正相色谱NPLC固定液极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱HPLC流动相选择原则保持色谱柱的稳定性化学惰性适合所用的检测器对样品有一定的溶解能力清洗、更换方便、毒性小沸点、粘度等物理性质合适HPLC流动相正相洗脱 流动相的极性小于固定相的洗脱反相洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱洗脱方式：等度洗脱(isocraticelution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradientelution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例装置：

高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱法优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度HPLC主要部件高压输液泵进样阀

色谱柱检测器HPLC主要部件(1)高压输液泵恒压恒流主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(2)进样阀

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：进样阀作用是将微量样品注入高压流动相中（3）分离系统——色谱柱对色谱柱要求高效液相色谱：硅胶和化学键合硅胶（C18，CN，苯基）离子色谱：离子交换填料分子排阻色谱：凝胶或高分子多孔小球色谱柱是HPLC的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。色谱装填得好坏（填充密度）对柱效影响很大。分离系统——色谱柱色谱柱是HPLC的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料主要是不锈钢。一般色谱柱长5～30cm，内径为4.6mm。分离系统——色谱柱固定相筛板：能够使液体通过而阻止固定相移动硅胶可耐高压、耐有机溶剂和水溶液易于引入多种官能团表面性质已被充分认识

缺陷：可承受的pH范围有限（2-8）聚合物可承受的pH范围广（1-14）柱效低（小分子）遇有机溶剂易溶胀基质类型化学键合反相固定相目前应用最广泛的一类固定相常见类型C18、C8Si-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-SiSi-O-Si-O-SiSi-O-Si检测器－色谱系统的眼镜紫外检测器（通用型、较高灵敏度）荧光检测器（选择性、高灵敏度）示差检测器（通用型、低灵敏度）蒸发光散射检测器（通用型、较高灵敏度）质谱检测器（通用型、高灵敏度）液相色谱检测器

a.紫外检测器

特点：适用范围广、灵敏度较高、线形范围较宽、对操作条件不敏感（流速、温度变化）可用于梯度洗脱

流通池类型基本原理：朗伯比耳定律紫外检测器的重要进展光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。液相色谱检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器

（refractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值与浓度呈正比特点：通用型灵敏度低对温度敏感、不能用于梯度洗脱R=z(n-n0)

溶剂折光指数（RI）温度水1.33320℃丙酮1.35820℃乙烷1.37520℃乙醇1.36218℃四氟呋喃1.40425℃乙二醇1.42720℃氯仿1.44618℃四氯化炭1.46315℃甲苯1.49620℃苯1.50120℃甲醇1.328620℃四氯化炭1.460320℃

荧光检