无菌检查法验证方案

XXX无菌检验方法学验证方案编号：VP.SV.039.00目录验证方案的审批验证小组名单验证实施进度技术性文件引言概述验证目的职责无菌检查方法学的确认再验证周期

验证方案审批方案起草签名日期质量监控部方案审核签名日期技术部质量监控部方案批准签名日期质量监控部

验证小组名单组长姓名成员职务部门成员姓名成员职务部门验证实施进度验证方案组织实施进度制定日期年月日实施日期年月日报告日期年月日技术性文件项目文件来源附录XIH无菌检查法2010版《中华人民共和国药典》公司GMP文件

引言概述根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。验证目的：根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验，寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。职责验证办负责验证方案的审批。负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。负责验证数据及结果的审核。负责验证报告的审核。负责再验证周期的确认。质量监控部负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。负责仪器、仪表、量具的校正。负责取样及样品检验。负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。负责拟订验证方案。负责组织试验所需设备。负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。负责保证设备的正常运转。

无菌检查方法学的确认验证环境、设备及实验前准备：无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。仪器和设备：=1\*GB3①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；=2\*GB3②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；=3\*GB3③AL204型电子天（梅特勒—托利多仪器有限公司）；=4\*GB3④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；=5\*GB3⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；=6\*GB3⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭州高得·泰林医疗器械有限公司）；=7\*GB3⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；。=8\*GB3⑧微孔滤膜（孔径0.45µm直径50mm）…供试品：品名规格批号剂型生产厂家所需培养基：硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定厂家：北京三药科技开发公司；改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106；灵敏度：应符合规定厂家：北京三药科技开发公司；营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司；改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司；稀释液、缓冲液：0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(配制方法参照chp2005附录—90页)验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102]生孢梭菌[CMCC（B）64941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取5瓶(管)，培养14天，结果应无菌生长。方法学验证:简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发挥作用。对革兰阳性菌、革兰阴性菌均有较强的抗菌作用。由于本品为液体眼用制剂，且其组分中含强抑菌成分，故计划使用薄膜过滤法，以PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液对本品进行方法学验证。检查方法：根据2010版《中华人民共和国药典》规定：凡供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。（检验量：10瓶；供试品用量：20ml；培养基用量：100ml菌液的制备：（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至100ml营养肉汤中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释，制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释，制成制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。菌悬液。。（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3-5ml含0.05%（ml）聚山梨80的酯0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，用管口带有薄的无菌棉花的无菌吸管吸出菌液，用装有脱脂棉的小漏斗过滤，除去菌丝后收集菌悬液，用接种环取1环至10ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，取0.1ml接种至改良马丁琼脂培养基，23～28℃培养72小时培养后制成制成每1ml含菌数小于100cfu的孢子悬液。（4）接种生孢梭菌新鲜菌悬液用10倍递增稀释法接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24小时，轻轻取此培养液，勿摇，观察培养基中悬挂的灯笼状菌落，计数，使菌数制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液菌落计数，（结果见相关记录）取金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1m1分别接种于营养琼脂培养基中，生孢梭菌接种至含1．5％琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃生化培养箱培养24～48h，取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1m1分别接种至改良马丁琼脂培养基中，经23培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，生孢梭菌，各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，取每管9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养管菌生长良好，判断该培养基的灵敏度检查符合规定。供试液的制备：无菌操作，取供试品10瓶，注入无菌锥形瓶内混匀，取滴眼液原液10ml供一株试验菌使用。试验组(样品+阳性)取一次性全封闭集菌培养器(三联装)一套，先用少量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取样品15瓶溶解于100ml缓冲液中，按薄膜过滤法过滤，样品过滤完毕后，再用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每管注入冲洗液100ml，充分振摇，完全排空后，总冲洗量达到500ml每管。冲洗完毕后在2管中分别注人改良马丁培养基100ml，另1管中注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml。另取一套集菌培养器(三联装)取本品依上述方法过滤并冲洗后，均注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，将上述6管集菌培养器移至阳性对照室，于含硫乙醇酸盐流体培养基的集菌培养器中，分别接种金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌茵液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各1ml，于含改良马丁培养基的集茵培养器中，分别接种白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各1ml，按前述规定温度培养3～5天，观察结果。阳性对照组取一次性全封闭集菌培养器(三联装)二套，4管中分别注入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml、2管中分别注入改良马丁培养基各100ml，在阳性对照室内将6种菌液分别接种至相应管内，作为阳性对照，按前述规定温度培养2～3天，观察结果。阴性对照组取一次性全封闭集菌培养器(二联装)一套，滤过适量缓冲液后分别注入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml，作为阴性对照，按前述规定温度培养14天，观察结果。样品的无菌检查取样品15支依上述方法同法操作，以500ml／管的冲洗量冲洗，加入培养基后，按规定温度培养14天，逐日观察，若培养14天均澄清；由此判定供试品符合规定。

结果及记录：见相关报告结果判断：试验组各培养器中试验菌与阳性对照组比较均生长良好，说明该供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用（或其抑菌作用可忽略不计），可以照此检验方法和检验条件进行该供试品的无菌检查。如试验组各培养器中试验菌与阳性对照组比较至少有一种菌株生长微弱、缓慢或不生长说明该供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基用量，或使用中和剂或灭活剂，更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行方法学验证。结论：检查人：日期：复核人：