第四讲-植物病害生物防治的研究方法

第四讲植物病害生物防治的研究方法

假如把地球演化到今天的历史浓缩到一天，地球诞生是24小时中的零点，地球诞生-零点，地球的首批居民-厌氧性异养细菌早晨7点钟好氧性异养细菌-午后13点左右，鱼和陆生植物-晚上22点；人类-一天的最后一分钟才出现。1首批居民—厌氧性异养细菌好氧性异养细菌4人类3鱼和陆生植物尽管人类对微生物的利用已有几千年的历史，现代微生物学也经历了一个多世纪的发展，但至今，为人们所认识的微生物种类仍仅占自然界中微生物总数的1%～5%，人类生产和生活中开发利用的则更少。因此，微生物可能是地球上最大的、尚未有效开发利用的自然资源。

目前已知的细菌不足6000种（估计在30000种以上），真菌不足80000种（估计在1500000种），目前为人类所了解的数目约占总数的5％；仅有约1%保存于世界各地菌种中心，并被开发利用。

一个国家对生物资源掌握得越多、研究得越深入、利用得越充分，就越能掌握自己国家的未来发展。科学家们普遍相信，至少20%以上的昆虫肠道系统或体内均可分离出多种单一宿主的绝对寄生微生物。因此，在昆虫种类数目未清楚前，所有微生物种类的数量都可能被低估。随着人类对生命过程认识的加深，生物技术已成为实现社会可持续发展的最有潜力的技术手段。

利用拮抗微生物或拮抗微生物产生的次生代谢产物来防治植物病害是植物病害防治中十分重要的有效措施之一。拮抗微生物具有不易使病原菌产生耐药性，对人畜安全无毒，不污染环境，无残留，不伤害有益微生物，能保持生态平衡，而且生产工艺较简单，开发和登记费用低于化学农药，以及不少拮抗微生物同时具有对作物的促生作用等特点而引起越来越多的人们的关注和重视。

从50年代起，国内外许多科研机构、高等院校以及商业公司都开展了利用拮抗微生物防治植物病害的研究。目前己经分离筛选到一大批对各种植物病害具有不同程度防治效果的各类拮抗微生物，其中有相当一部分己经获得农药登记进入商品化。

自然界的微生物资源非常丰富，利用有益的拮抗微生物进行生物防治的开发潜力很大，采用遗传工程的方法改良生防菌株，进一步提高生防效果，扩大生防范围具有巨大的经济价值和效益，为开发无公害、绿色食品和保护环境开辟了广阔的道路。第一节拮抗微生物的分离培养一、样品采集

（一）土壤拮抗微生物

土壤具有微生物生长繁殖所需要的一切营养物质及各种条件，因此土壤是微生物良好的生活场所，有“微生物的天然培养基”之称。土壤微生物种类繁多，数量极大，其中以土壤表层或耕作层中及植物根附近微生物数量较多。土壤越肥沃，微生物种类和数量越多。地球表面存在大量的微生物土壤微生物（Soilmicrobe）雪域高原微生物（1）细菌

土壤中数量最多的微生物。占土壤微生物总量的70%～90％，田间土壤中一般为106～108个/cm3，其中上层15厘米的土壤中，细菌鲜重为1500-3700公斤/公顷。土壤细菌soilbacteria革兰氏阳性菌Gram+

节杆菌属Arthrobacter芽胞杆菌Bacillus梭菌属Clostridium

革兰氏阴性菌Gram-假单胞菌Pseudomonas根瘤菌Rhizobium,（大豆根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicum）

固氮菌Azotobacter亚消化单胞菌Nitrosomonas硝化甘油菌Nitrobacter农杆菌Agrobacterium2.大肠杆菌Escherichiacoli1.芽孢杆菌Bacillussubtilis3.棒状杆菌Corynebacterium细菌种类杆状菌Bacillus梭菌属Clostridium内生芽胞杆菌Endospore-bearingbacteria假单胞菌Pseudomonasaeruginosa阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeBordetellapertussis乳酸菌Lactobacillus链球菌Streptococcussobrinus葡萄球菌Staphylococcus葡萄球菌Staphylococcus螺原体Spirillum

Borreliaburgdorferi蓝藻细菌Cyanobacteria（2）放线菌

是土壤中另一类主要的微生物类群，数量仅次于细菌，占微生物区系总量的13～14%。放线菌多存在于偏碱性的土壤中，大部分土壤放线菌属于链霉菌科的三个属：链霉菌属（Streptomyces）小单孢菌（Micromonospora）诺卡氏菌属（Nocardia）土壤或根围中的链霉菌大多数种都归于链霉菌属。放线菌虽然数量比细菌少，但由于其菌丝体的体积比单个细菌大几十倍甚至几百倍，所以在土壤中的生物量也相近于细菌。放线菌Actinomycetes

目前已发现的微生物产生的上万种抗生素中，70%以上是放线菌产生的。土壤是放线菌栖居的重要场所，其理化性质和土壤形成环境强烈影响并决定着土壤放线菌的种类、数量及其分布。从土壤中获得具有高效抗菌活性的抗生素产生放线菌，是目前世界范围内研制开发新医药和新农药必不可少的基础工作。

（3）土壤真菌

数量排第三位。土壤中的真菌各种类型都有，以半知菌类为最多，主要分布于土壤表层中。真菌和细菌（Fungiandbacteria）CulturableandunculturableFungibacteria有机营养型或异养型微生物：只利用现成有机物质的微生物。无机营养型或自养微生物：一些靠二氧化碳和碳酸盐自食其力的微生物。微生物具有极强的抗热、抗寒、抗盐、抗干燥、抗酸、抗碱、抗缺氧、抗压、抗辐射及抗毒物等能力。相互作用ComplexityInteractionsL1L2CnbL1L1ThelichenPeltulaUnidentifiedlichenMicrocoleusvaginatus地木耳NostocN2N2与地衣共生藻类（二）根际促生微生物

根际是指生物和物理特性受根系紧密影响的区域，它与微生物群系共同构成一个极复杂的生态区系，是确保植物根系生长发育正常进行的生境场所，也是植物与外界环境进行物质与能量交换的主要场所，此处微生物多样性丰富，具有强烈的根际效应。因此，根际微生物所形成的微生物环境对植物生长起到极其重要的作用。

根际存在着许多对植物有益的细菌群落，包括生防细菌、能生产植物生长激素的细菌和固氮菌等。根际有益细菌能够促进植物对矿质营养的吸收和利用，或者产生促进植物生长的代谢物，甚至抑制有害微生物。因此，这类能够直接或间接促进植物生长的细菌又被称为根际促生细菌（Plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR）。

根际促生细菌主要通过两种方式发挥作用：1）抑制植物的病原微生物和减轻病原菌的毒害作用。2）PGPR也可以通过其它方式促进植物生长，如固氮作用、促进营养物质（如磷）的溶解、促进菌根功能、调节根部乙烯的产生、释放植物生长素及减轻重金属毒性等。

在农业生态系统中，充分利用这些细菌的生物学潜力将有助于减少化肥和农药投入、促进植物生长、减轻环境污染，实现农业可持续发展。（三）植物附生与内生拮抗微生物

人们早巳发现绿色植物叶（果）面栖居有大量微生物。在一百多年前微生物学家就从植物叶面分离到许多真菌和细菌。1910年Potter首先证实，叶面附生微生物在干扰真菌引起的叶部病害中起着重要作用。上世纪50-60年代，Last和Ruinen从分别对禾谷类作物叶面和热带森林叶表微生物生态进行系统研究以后，极大地促进了人们对叶面微生物的研究，近年来不断涌现的病、虫、草害生物防治成功的事例进一步激发了人们对叶（果）部病害生物防治的兴趣。

植物内生菌作为微生物中的重要类群，其种的数量庞大。植物的生长环境直接影响内生菌的生物多样性，而植物种植的年代也直接影响其生物多样性、抗病虫性，年代越久远，其内生菌的生物多样性越丰富；抗病和抗虫性越强的植物，其所含的内生菌具有抗菌和杀虫活性的可能性就越大；具有药用性能的植物，其所含的内生菌有可能产生植物相同或相似的活性物质。

有数据显示，51%的从药用植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为38%。由此可见，研究药用植物内生菌，寻找具有农药活性的次生代谢产物是研发新型生物农药的重要途径。（四）海洋拮抗微生物

占地球面积71%的海洋环境非常复杂，造成生活在其中的生物在物种、基因等方面都异于陆地生物。从20世纪80年代开始，国内外对海洋微生物的研究越来越多，随着生物技术的进步，更加促进了海洋微生物的开发利用。其中许多海洋微生物的次级代谢产物对农业病虫害有很好的抑制作用。

随着陆生资源的不断减少，人们在陆地资源中找到适合开发的生物资源越来越困难了，所以更多的人们将眼光转向了占地面积更广，开发较少的海洋资源上。生活在其中的微生物由于其生活环境异于陆生生物，造成其产生的活性物质与陆生微生物有明显的不同，因而具有更大的开发价值。温泉水微生物AnimalsPlants水体微生物(苏联)东方号站南极冰川微生物BacteriainAntarticicecoresMineDrainage矿山水二、分离与培养（一）一般分离方法

不同来源的微生物种类繁多，其分离的方法不同，而同一材料又可以用不同的方法分离，常用的微生物分离方法可以分为两大类，即组织分离和稀释分离法。[1]组织分离法

多用于植物内真菌的分离。取植物组织块用清水洗去污泥后，在超净台上无菌水清洗数次后，用75%（v/v）酒精中浸泡数秒，消除表面气泡，再用5%（m/v）次氯酸钠或0.1%升汞浸泡消毒后，立即用无菌水洗涤数次，用灭菌纸吸干水分，然后用无菌剪刀将各组织剪成4-5mm小块，接种于培养基平板上。组织分离法[2]稀释分离方法

将材料充分研磨或分散后，配成悬浮液，经稀释后与熔化并冷却到45℃左右的琼胶培养基混合，然后倒在灭菌的培养皿中。稀释分离法可以使细菌、放线菌菌落充分分散开，容易分离得到纯培养。稀释分离法方法：培养皿稀释分离法平板划线分离法稀释涂布法等。培养皿稀释分离法稀释涂布法平板划线分离法（二）各种材料微生物的分离培养方法1.土壤微生物分离与培养

首先要制备土壤溶液，将土壤溶于水中，然后配置基本培养基，将土壤溶液可以采取涂平板的方式，涂在基础培养基上，培养出土壤溶液中的全部微生物，选择所需的菌种，然后再配制选择培养基，根据要筛选的细菌的营养类型，选择培养基，比如，抗性、营养缺陷型等，选出单菌落，进行多次划线培养，最终可筛选出想得到的微生物。具体步骤：1.1样本采集及处理为了获得种类齐全的菌种，采集土样时，需要综合考虑不同微生物生存的环境条件。例如，酵母菌主要分布于含糖较丰富且偏酸的环境，因此应选取有机质丰富的多年果园或瓜园土样为宜。采样时，铲除表土，垂直取距离地表5～15cm深度的土壤。土样带回实验室进行处理，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释浓度的土壤菌悬液。1.2培养基的配制根据四大类微生物适宜营养条件的差异，需配制不同的培养基。分离微生物的培养基应该使用常规的选择培养基，而不宜选用特殊的选择培养基。细菌、放线菌、酵母菌、霉菌四大类微生物选用的培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、PDA培养基和马丁氏培养基。

为了最大限度地避免杂菌污染，需要在培养基的成分中添加适宜的杀菌剂或抑菌剂，以保证所得实验菌种的质量。如高氏1号培养基中添加75μg/mL浓度的重铬酸钾，可减少细菌及真菌的数量；PDA培养基和马丁氏培养基分别添加50μg/mL和30μg/mL浓度的链霉素用以分离酵母菌与霉菌。配制完毕后调节pH值，各自分装于三角锥形瓶中，120℃灭菌20min，备用。培养基配制的一般过程培养基制作过程

1、准备工作2、称量、材料预处理3、煮熬4、过滤、加可溶性药物5、熬琼脂、定容6、营养液分装7、灭菌处理8、摆斜面9、倒平板

在培养基冷却到50C°左右时，在酒精灯附近倒平板或制斜面。10、无菌检测1.3接种及培养每个实验组取9套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明培养基类型、土壤稀释液的稀释度、组别、操作日期等。然后，用所指定的培养基制成空白平板。冷凝后，用无菌吸管分别吸取3个稀释浓度的菌液各0.1mL（分离细菌取10-7～10-5，分离放线菌、酵母菌、霉菌取10-5～10-3）。用无菌三角涂棒将菌液均匀涂布在培养基表面，每一稀释度涂布3个平行样，将培养皿放入恒温培养箱中。

培养时注意将平皿倒置，一方面可以防止培养基过分失水干裂或缩小，另一方面可以避免皿盖上的冷凝水滴到正在生长的菌落上，影响后期的观察和使用。

温度是影响微生物生长的重要因素之一。不同种类的微生物，对外界环境的温度要求不同。细菌的常规培养适宜温度为35～38℃。酵母菌培养温度最好控制在28～30℃。放线菌及霉菌菌生长的最适温度是28～32℃。在相应的培养温度下，细菌与酵母菌的培养时间为2～3d，霉菌则需要3～7d，放线菌的培养时间比霉菌长一些，一般需要5～10d才能长成菌落，少数生长缓慢的种类所需时间更长至半个月之久。

上述方法也可用于植物附生微生物的分离培养，与土壤微生物不同的是植物附生微生物需要将叶（果）面微生物冲洗下来后进行。2.植物内生菌的分离与培养

植物的根、茎、叶、花、果实等器官的组织中均有内生菌存在。通常选取长势好、无病害的植株，采用直接切取植物组织分离的方法或榨取植物组织汁液稀释分离的方法从植物体中分离内生菌。一般来说，一个典型植物内生菌的分离步骤包括以下几步：1）材料的收集；2）采集所需要的部位到实验室；3）组织的清洗；4）表面消毒；5）利用无菌操作技术将组织切割成1-2cm；6）第二次表面消毒；7）将植物组织直接接种于生长培养基上或者将消毒后的材料研磨再取汁液涂布平板；8）对寄主植物的再接种与再分离。2.1内生细菌的分离与培养从健康植物组织中分离内生细菌的方法很多，关键在于植物表面要完全消毒，从而保证所分离的细菌都来源于植物组织内部。目前，所采用的消毒方法一般都是常规的次氯酸钠、乙醇和升汞消毒。但是不同的植物或植物的不同部位、不同生育期，其结构或生理特性都不同，因此，对其表面所采取的消毒方式也不同，samish等曾对不同的消毒技术进行比较，并形成标准的程序：首先，用自来水或商品净化剂反复冲洗植物表面，按照材料的不同决定次氯酸钠、乙醇或升汞的浓度和最佳的消毒时间，再用无菌水冲洗，最后，用无菌滤纸吸干水分。目前，大多采用的都是这种消毒方法。为了确定消毒是否彻底，可将最后一次冲洗过植物组织的水涂布平板，若无细菌则可以证明分离到的细菌全部都是内生菌。将表面消毒过的植物材料进行进一步分离，通常有两种方法：①组织块分离：把组织材料切成薄片或将有汁液的果实材料用消毒移液管刺入内部吸取汁液涂于平板培养基上。这种技术方法操作简单，可减少污染，但由于细菌在植物组织内的分布不均匀，分离内生细菌数量和种类少，不能代表整个植物材料的内生细菌的数量和种类。②稀释分离法：将植物材料捣碎放在无菌研钵中，加入无菌水或生理盐水充分研磨，吸取汁液并稀释后涂布平板。这种分离方法操作也比较简单，分离得到的内生细菌数量和种类也比较多，但对一些比较难研碎的植物材料，比如某些植物的根、树木的木质部等，不易捣碎和研磨。因此，需要根据不同的组织或材料选取较为适宜的分离方法。

分离植物内生细菌很关键的一步就是培养基的选择。同一种材料，因培养基的不同，分离的结果无论是细菌的种类还是细菌的数量，均存在较大的差异。一般常用的培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、牛肉膏蛋白胨培养基（NA）和蛋白胨酵母膏培养基（LA）等。随着细菌遗传学的发展以及对植物与内生细菌关系的进一步研究，人们为了获得不同种类的内生细菌，常根据其特性选择不同的培养基，例如，分离荧光假单胞可选择KB培养基（2%蛋白胨、1%甘油、0.15%K2HPO4、0.15%MgSO4·7H2O、1.5%琼脂，pH=7.2）培养，然后在紫外灯下检测是否有荧光；还可以在一些常用的培养基的基础上补充糖、无机盐、有机盐等成分，从而分离富含糖、无机盐、有机盐的植物组织中的内生细菌。此外，在分离所需内生细菌的培养基中还应该加入抑制剂，抑制真菌等杂菌的生长。不同的植物材料选择不同的培养温度和培养时间，尽可能的获得更多的内生细菌。尽管如此，组织分离的方法还是存在一定的局限性，除了培养基的成分选择收到一定的限制外，仍然不可避免的会漏掉那些寄生程度高，与植物密切相关的内生细菌，因此，内生细菌的分离方法还有待于更进一步的改进。2.2内生真菌的分离与培养

从不同类型的植物组织中分离内生真菌的消毒方法在不断地改进，消毒溶液的浓度和清洗时间有些不同，但目前最常用的是乙醇、次氯酸钠和乙醇三部消毒法。研究结果表明，三步消毒法可以有效的去除表明的厚壁子囊孢子和分生孢子。需要注意的是：在消毒前，先对样品进行自来水的清洗时非常重要的，它可以减少消毒花费的时间。对样品的预处理，还可以使用超声波和消毒剂等方法。总之，预处理是非常重要的，如果单独使用三步消毒法，一些镶嵌在组织表面的真菌可能没被杀死，以至于当做内生真菌被分离出来。

培养基的选择在内生真菌的分离过程中也是非常重要的，通常是应用“非选择性”培养基，以利于尽可能的分离到更多的真菌，迄今为止内生真菌可以在所有的人工培养基上生长，如麦芽提取物琼脂培养基（MEA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）等。但是一些生长快速和容易产孢的菌株经常覆盖了生长缓慢的菌株，所以需要通过一些方法减慢或限制真菌的快速生长，便于分离到生长缓慢的菌株，以便更全面的调查内生真菌群落的组成。现在常用的方法是在琼脂培养基中加入一些能限制菌株的快速生长，但并不引起细胞死亡的试剂，如抗生素类。3.海洋微生物的分离与培养

海洋环境中蕴含着丰富的微生物资源，其在生态系统中发挥着重要作用，与人类生活息息相关。但是迄今通过传统的培养方法可被培养分离的海洋微生物不到1%。主要是由于传统培养方法存在一些局限性，只有少部分的海洋微生物能够得到纯培养，表现在以下几个方面：(1)实验室培养条件同自然条件的差异影响了海洋微生物的可培养性。许多微生物在自然环境中处于共生状态，或受其他微生物及其代谢产物的影响，海洋微生物在培养基上不能生长是由于离开了原来的共生环境，破坏了它们之间的共生关系以及一些必需生长信号的交流。例如一些海洋细菌处于活的非可培养状态，为适应不良环境整个细菌细胞缩小成球形，在培养基上于常规条件下培养时，不能生长繁殖，需要提供特殊的培养条件方可获得培养。(2)微生物之间的拮抗作用导致了一些海洋微生物生长受抑制。

当微生物从自然环境进入人为环境时，一些环境适应性强的优势菌群快速生长，在此过程中产生大量过氧化物、超氧化物以及自由基等有害物质，这些物质能对细胞造成氧化胁迫从而使细胞受到损伤，因此使适应能力较差或生长缓慢的菌群受到抑制，难以在固体培养基中形成菌落。以上原因导致了大量的海洋微生物资源被埋没，极大地限制了海洋微生物的应用。海洋微生物分离培养常用的方法有：3.1稀释培养

稀释培养是指将样品稀释到已知数量的细胞浓度后，接入灭菌海水中进行培养的一种方法。Button等采用稀释培养法结合流式细胞仪研究海洋细菌多样性，结果发现，稀释培养九周后的微生物细胞浓度可达到104/mL，细胞的倍增时间差异明显，短的只需一天，长的达一周。戴欣等比较了普通培养和稀释培养的分离效果，发现稀释培养基上生长的细菌数量普遍是普通牛肉汁琼脂培养基上生长的细菌数量的3~5倍，通过稀释培养可以获得更多的纯化菌株。3.2高通量培养

为了提高分离效率，Connon等在稀释培养法的基础上提出高通量培养方法。该方法是将样品浓度稀释至103/mL后，采用48孔细胞培养板分离培养微生物。通过高通量培养技术可将样品中14%的微生物纯培养出来，远高于传统分离技术所培养的微生物数量。3.3扩散盒培养

为了能够让海洋微生物在原位条件下进行富集生长，最终得到纯培养的微生物，Kaeberlein等设计开发了扩散盒培养方法。该扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1μm滤膜组成，将含有海洋微生物的样品加至封闭的扩散盒中，在模拟采样点环境的玻璃缸中进行培养。这种方法的优点是最大程度上模拟微生物所处的自然环境，环境中化学物质可以自由交换、微生物群落之间可以相互联系，保证微生物生存环境的原位性，从而提高微生物的可培养性。3.4微囊包埋技术

微囊包埋技术是另一种高效、高通量的海洋微生物分离技术。Zengler等将海水和土壤样品中的微生物进行稀释后制成包埋单个微生物细胞的琼脂糖微囊，然后将微囊装入凝胶柱内流态培养，结合流式细胞仪进行检测，获得大量纯培养微生物，同时发现了一些新的细菌16SrRNA基因分支。通过进一步研究表明，微囊包埋技术可以用于超过10000个环境样本中的细菌和真菌的分离。美国Diversa公司利用该方法成功培养出一些新菌种，获得较高的分离效率，但由于该方法建立的时间较短，还存在一些如包埋基质透性差、微生物热敏感等技术问题。

综上所述，海洋微生物可培养技术在近年来得到了一定的发展，但仍然无法满足人类探索海洋的迫切需要，因此还需要在进一步研究海洋微生物生理生化特性的基础上，结合分子生物学技术，创建一些新的更能模拟海洋环境条件的培养方法，为海洋微生物资源的保护和利用提供更多的新菌株。三、菌种的保藏

菌种是国家的重要资源，是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产更离不开菌种。所以，菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其目的是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。1.微生物菌种保藏的基本原理

菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。目前，常采取低温、干燥、缺氧3种方法，使菌种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法在能长期保持菌种原有的优良性状不变的基础上，还应考虑到操作方法的简便性和经济性，以便生产上能推广使用。2.微生物菌种的保藏方法2.1定期移殖法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养（保藏厌氧细菌用）等。将菌种接种于是以的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6℃进行保存，间隔一定时间后需进行移殖培养。保藏时间依微生物的种类不同而不同。

此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易变异。只能作为菌种的短期保藏。2.2液体石蜡保藏法亦称矿物油保藏法。选用优质化学纯液体石蜡，采用以下两种方法进行灭绝：①121℃湿热灭绝30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。②160℃干热灭绝2h，冷却后，经无菌检查后备用。把液体石蜡注入已长好菌的斜面上，并高出斜面顶端1cm，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温（4-6℃）干燥处或室温下保存。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。

此方法简便有效，保藏时间2-10年，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别是对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。缺点是必须直立存放，占空间大，不便携带。某些以石蜡为碳源或对液体石蜡保藏敏感的菌株，不能用此法保藏。2.3沙土管保藏法取60~80目筛取河沙，用吸铁石吸去铁质，用10%盐酸浸泡24h后弃盐酸，用水洗至中性，将沙子烘干备用。取地表下40~60cm非耕作层贫瘠且黏性较小的土，研碎后100目过筛并用水洗至中性，烘干备用。将处理后的沙、土按质量比2：1混合。混匀的沙土分装入安瓿（bu）管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭菌30cm，无菌检测合格后方可使用。把制备好的菌悬液分装每支沙土管0.5ml，放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥剂的容器中，用真空泵抽去水分。检测合格后封口，存放于低温（4~6℃）干燥处保藏，每隔半年验证1次。

本方法操作简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存两年，但对营养细胞不适用。由于在真空干燥过程中，机械力容易造成孢子的死亡，因此，在保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法接种。2.4真空冷冻干燥保藏法安瓿管用2%盐酸浸泡过夜，用自来水冲洗并用蒸馏水浸泡至pH中性，烘干后加入脱脂棉塞，灭菌备用。保护剂可选择血清、脱脂牛奶和海藻糖等。将培养好的菌体或孢子加入保护剂制成菌悬液，分装于安瓿管中，每支0.2ml。然后放入冰箱冷冻2h以上，当菌悬液温度达到-20~35℃左右。将安瓿管在真空条件下熔封，低温或常温保藏。此法为菌种保藏方法中应用最广泛的，是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，几乎所有的微生物均可采用此法保藏。此法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。方便之处在于因冷冻干燥管无须低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵。2.5冷冻保藏法2.5.1普通冷冻保藏技术（-20℃）将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口，置于普通冰箱中保藏。这一方法操作简单但不适宜长期保藏。2.5.2超低温冷冻保藏技术（-80~-60℃）将生长至对数生长中后期的微生物细胞，加入新鲜培养基使其悬浮，然后加入等体积的20%甘油或10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻管或安瓿管中，于-70℃超低温冰箱中保藏。某些细菌或真菌菌种可通过此保藏法保藏5年而活力不受影响。2.6基因工程菌的保藏2.6.1穿刺保藏法在容量为2~3ml旋盖玻璃小瓶中加入约2/3容量的LB琼脂，灭菌后备用。用接种针挑取保藏菌株单菌落，针刺至瓶底，在适当温度下培养过夜后避光保藏于4℃或室温。穿刺法可保藏细菌2年。2.6.1甘油管冷冻保藏在细菌培养物中加入适量甘油（使甘油终浓度为15%），分装至保存管，置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法可保藏菌种1~10年。

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性。因此。生物菌种在具体选择保藏方法是必须对被保藏菌株的特性，则要尽可能多地采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。第二节拮抗微生物的活性评价方法离体抑菌活性测定1.1待测细菌-病原真菌平板对峙法将病原菌接种于PDA平板培养基中央，28℃培养，待菌丝长满培养皿，用孔径5mm的打孔器（蓝枪头）制作菌饼，将菌饼接到，PDA平板中央，离菌饼约3cm处，用接种环蘸取培养24h的菌株，在平板表面各划1条约3cm的细线，以只接菌饼为对照，放于28℃培养，7天后，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率。每个处理3次重复。菌落生长抑制率按下式计算：菌落生长抑制率（%）=（对照菌落净生长距离-处理菌落净生长距离）/（对照菌落净生长距离）×1001.2待测真菌-病原真菌平板对峙法将待测菌、病原菌接种于PDA平板培养基中央，28℃培养，待菌丝生长良好时，用孔径5mm的打孔器制作菌饼，将菌饼接到PDA平板中央。用同样方法打取待测菌菌饼，放置于离菌饼约3cm处，以只接菌饼为对照。放于28℃培养，7天后，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率。每个处理3次重复。菌落生长抑制率按下式计算：菌落生长抑制率（%）=（对照菌落净生长距离-处理菌落净生长距离）/（对照菌落净生长距离）×1001.3待测细菌-病原细菌牛津杯法将病原细菌摇菌后，以病原菌液：NA培养基为1：20的比例制成带菌平板，中间放一牛津杯，待培养基凝固后，向牛津杯中注入0.1ml的待测菌液，以注入NA液体培养基为对照，每个处理3次重复，于28℃培养48h，观察抑菌情况，测量抑菌圈直径。

1.4纸片扩散法：将滤纸片（Φ=5mm）浸泡在上述提取液和发酵滤液中过夜，使其充分吸收，微风略吹干后，平放于含有测试菌的培养基中，3次重复，并用相应的提取液作空白对照。制备好后的培养皿在37℃恒温培养，24h后观察，测其抑菌圈的大小，并根据抑菌圈大小计算出抑菌率。抑菌率（%）=（供试菌落直径-对照菌落直径）/供试菌落直径×1001.5待测菌-病原细菌无菌滤液抑菌法带菌平板制备方法同1.3，以注入NA/YE/PDA液体培养基为对照，每个处理3次重复，于28℃培养48h，观察抑菌情况，测量抑菌圈半径。1.6待测菌-病原真菌无菌滤液抑菌法挑取在对峙培养时有明显抑菌作用的菌株于NA/YE/PDA液体培养基中，在28℃，130rpm的摇床中振荡培养，将发酵液于4000rpm离心3min，上清液经0.2μm孔径的滤膜过滤，取无菌滤液2ml加入到冷却至50℃左右的18mlPDA培养基中，轻轻摇匀，倒入孔径为9cm的培养皿中，制成平板，以加NA/YE/PDA液体培养基为对照。用灭菌的打孔器（蓝枪头）打取直径0.5cm的新鲜病原菌菌饼置于PDA平板中间，于28℃恒温培养箱中培养7天，计算抑菌率。

抑菌率（%）=（对照病原菌真菌-测试病原菌直径）/对照病原菌直径×1002.活体抑菌活性测定2.1果实针刺测定法（1）保护作用测定法采摘健康新鲜的、形状和大小均一的果实（带蒂），表面用75%酒精擦拭消毒，晾干备用；将待测样品用蒸馏水稀释成不同浓度供试，用小型喷雾器喷于果实表面，底部铺入滤纸并加无菌水保湿，24h后接种病原菌菌饼，接种时用无菌接种针轻轻刺破果实表皮，将3块直径为4mm的病原菌菌饼等距离反接在果实表面有破口处，置于25℃下保湿培养。（2）治疗作用测定法果实处理和接种方法与保护作用测定相同，区别是先在25℃保湿条件下接种病原菌菌饼，24h后再喷施供试待测菌菌液，之后将其置于25℃下保湿培养。以上保护作用测定和治疗作用测定每浓度处理均设3次重复，每个重复用果实3个，以相应的待测菌菌液作为对照。4天后测量各处理及对照的病斑直径，计算相对防效。采用以下公式计算相对防效：

病斑直径（mm）=测量直径-4.0（菌饼直径）

相对防效（%）=（对照病斑直径-处理病斑直径）/对照病斑直径×1002.2真叶法（1）保护作用测定方法采摘健康新鲜叶龄相同的植株真叶，洗净放于吸水纸上将表面水分晾干。采用Potter喷雾法于真叶上施待测菌菌液，晾干菌液后，在真叶正面的中间部位接种1块4mm直径的病原菌菌饼，放入铺有吸水纸的培养皿中，并用浸水的棉花球包裹叶柄以保湿。25℃暗培养。3天后测量各处理的病斑直径。（2）治疗作用测定方法先在真叶上接种病原菌年菌饼，25℃暗培养，24h后，再施待测菌菌液进行培养（培养条件及施药方法与保护作用测定方法相同）。3天后测量各处理菌落直径。以上保护作用测定和治疗作用测定每浓度处理均设3次重复，以喷施待测菌菌液为对照。采用以下公式计算相对防效：病斑直径（mm）=测量直径-4.0（菌饼直径）相对防效（%）=（对照病斑直径-处理病斑直径）/对照病斑直径×1002.3伤根接种法制备待测菌菌悬液和病原真菌孢子悬浮液。取同一基因型的组培苗种于盆中，待其长到一定高度时，用伤根法接种。设3个接种处理：Ⅰ为同时接病原菌和待测菌；Ⅱ为先接病原菌，后接待测菌；Ⅲ为先接待测菌，后接病原菌；以只接病原菌为对照。每一处理10株。接种后挂号标签，置于温室保湿培养，2个月后统计盆栽植株发病情况。不同作物的病情分级有不同的标准。第三节拮抗微生物的鉴定和多样性分析一、菌株鉴定1.细菌菌株鉴定1.1细菌常规鉴定技术传统细菌分类的主要依据是形态学、生理学和生态学特征，在长期的研究过程中建立了许多分类鉴定的方法，这些方法统称表型分类学。1.1.1形态结构和培养特性观察个体形态学特征，由于细菌的个体形态学特征不是受单个基因的控制，而是受多个基因的共同影响，个别基因的突变一般不会导致个体形态的明显变化，因此，在特定的培养条件下，不同细菌的个体形态，存在相对稳定性和特异性。加上个体形态易于鉴定，所以其个体形态学特征可以作为细菌分类鉴定的主要依据之一。微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上的特性，根据不同微生物在形态结构上的不同区别鉴定微生物。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征存在很大差异，而同一种细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性，可以据此对微生物加以区别。因此，微生物培养特性也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。1.1.2生理生化实验不同细菌具有不同的酶系统，因而它们对营养物质的需求、分解和利用能力、代谢途径以及代谢产物存在差别。细菌的很多生理学、生理化学特征比较稳定，可以作为细菌分类鉴定的重要依据。生理生化特征包括营养类型和其他的一些生理特征。微生物检验中常用的生化反应有糖酵解实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红（MethylRed）试验、靛基质（Imodle）试验、硝酸盐（Nitrate）还原实验、明胶（Gelatin）液化试验、尿素酶（Urease）试验、氧化酶（oxidase）试验、硫化氢（HZS）试验、二糖铁（TSI）琼脂试验、硫化氢-靛基质-动力(SIM)琼脂试验等。1.1.3血清学试验血清学分类就是通过在体外进行抗原抗体反应（即血清学反应）来分析比较细菌之间的抗原特性而进行分类鉴定的一种放法。根据细菌物质组成与结构的多样性，可以对细菌的各种抗原物质进行分析。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。血清学反应的一般特点：①抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。②抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定但是可逆的。③抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。④血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。血清学反应具有特异性强、灵敏度高、简便快捷等优点，在细菌分类中受到高度的关注和广泛的应用。由于同种或同属内不同菌株的抗原特性不同，从而可将它们分成不同的血清型[1]。抗原特性在细菌分类中的应用主要适用于抗原物质同源性程度较高的细菌（如种内不同菌株）之间的分析。目前，依据抗原特征对较高的分类单元,甚至对种进行分类还未能普遍采用。1.2分子生物学鉴定技术表型分类法虽然在细菌的分类和鉴定中发挥了重要的作用，但也存在着一些问题：表型表达可能不稳定，敏感度不高，不具有广泛的适用性，可能还受到血清变种的影响。由于细菌形状微小、显微结构简单、易于传播、一般缺少有性生殖过程等特点，依据形态学和生态学形状进行分类受到很大的限制，生理生化特征对于分析细菌的系统发育也存在局限性。因此，克服表型分类法的缺点，现代细菌学家积极地寻找和探索新的分类特征，采用了遗传学、分子生物学的技术方法，分析比较细菌的遗传物质基础，获得遗传学特征资料作为细菌分类的依据，在细菌分类领域中又产生了“遗传性分类法”，即分子生物学分类法。分子生物学分类法是建立在遗传物质的基础上，主要通过两条途径获得细菌遗传学特征的资料：一是对细菌染色体进行直接的DNA分析或对染色体外基因片段进行分析，因而从遗传进化的角度去认识细菌；二是通过遗传学方法如转化、转导或接合作用进行细胞之间的基因转移，以探讨细菌间的亲缘关系。1.2.1DNAG+Cmol%含量测定方法生物体的遗传物质DNA中4种碱基G、C、A、T的比例和排列顺序是决定DNA特性的关键因素，它代表着生物的遗传信息，决定生物的种类，每种生物都有其特定的G+Cmol%含量，动植物的G+Cmol%集中在35%~40%,细菌的G+Cmol%变动幅度达25%~75%，因此，G+Cmol%含量测定更适合于细菌的分类鉴定。一般认为，两株细菌的G+Cmol%差别<2%是无意义的，含量差别在2%~5%，可判定为同种内不同菌株；差别在5%~15%,可判定两株细菌同属不同种；差别>15%，可判定两株细菌不同属甚至不同科。

细菌G+Cmol%含量测定法具有一定的局限性。G+Cmol%含量不同的两个菌株，可肯定回答不是同种细菌，但G+Cmol%含量相同的细菌，不能武断的认为是相同或相似的细菌，因为G+Cmol%含量虽相同，但其碱基排列顺序（遗传密码）不一定相同，尚需结合表型鉴定确定或通过核酸杂交鉴定菌株间的亲缘关系。1.2.2核酸序列分析法随着PCR技术和DNA测序技术的快速发展，以及相应的成本降低，直接通过细菌DNA序列来进行分类的方法已经成熟。尽管可以通过测定不同细菌任一相同基因区段的序列加以比较来划分，但目前在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的分子钟是rRNA，其种类少，含量大约占细菌RNA含量的80%，分子大小适中，存在于所有的生物中，特别是进化具有良好的时钟性质，其结构与功能具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。rRNA在大多数原核生物中都具有多个拷贝，5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA的拷贝数相同，16SrRNA由于大小适中，约1.5kb左右，既能体验不同菌属之间的差异，又能利用测序技术来较容易地得到其序列，故被细菌学家及分类学家所接受。细菌的16SrRNA的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，所以，可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同均属、菌种的细菌进行分类鉴定。但较其他方法而言，16SrRNA序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。2．真菌菌株鉴定

真菌的鉴定就是依据真菌的形态或分子特征对其分类地位做出评判的过程。然而，真菌的系统分类一直面临着特殊的挑战，因为它几乎不存在化石、形态简单，许多种类都被简单地从形态上进行划分，尽管也许与它们真正的系统进化关系不一致。因此，真菌的分类显得复杂和繁乱。像其他生物的分类系统一样，真菌的分类也是从形态特征分类基础上发展起来的，表型研究是重要的分类途径。目前主要是使用合适的培养基培养真菌，观察、鉴别其特征：主要包括产孢结构的形态、大小、着生方式及孢子的形态大小以及其培养性状等。随着科学技术的不断发展和真菌分类学自身发展的客观要求，在真菌的现在分类学中引入了操作方便、特异性好且准能却可靠的分子生物学技术鉴定方法。尤其是对相关属、复合种或亚种的鉴定分类时，利用真菌较保守的18SrDNA以及ITS序列进行系统发育积累分析和真菌的多样性研究已经成为有效而快速的手段。也有用真菌的18SrRNA基因同源性分析方法对真菌进行分类鉴定的。ITS（InternalTranscribedSpacer）在真核生物中，指rRNA基因内转录间隔区，是rDNA上的一个非编码区域，它包括ITS-1（位于18SrDNA和5.8SrDNA之间）5.8SrDNA和ITS-2（位于5.8SrDNA和28SrDNA之前）区，该区域受外界环境的影响较小，与编码区相比具有进化速度快的特点。真菌的ITS具有属内种间差异明显，而种内较为一致的规律性，而且基于rDNA-ITS的序列分析由于可以从太长的核酸序列中获得相对足够的信息来反映生物亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的特点，目前，已广泛应用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究。二、多样性分析1.培养（Culture-dependent）方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合待分离微生物的生长条件，如选择合适的营养成分、酸碱度、温度和氧等造成只利于该微生物生长而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，并且微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此，可通过挑取但菌落而获得一种纯培养。其基本流程是：倒平板就→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存→根据菌株的生理生化、生态和遗传特征等对其进行鉴定。但是由于环境中微生物群落结构非常复杂，物种多样性极高，纯种分离富集培养的方法不但费时费力，而且存在致命的方法学上的缺陷：①自然界大量微生物的不可培养性，使人类无法培养自然界中所有的微生物；②分离富集培养方法具有强烈的选择性，使培养得到的微生物在种类数量和功能上都无法反映自然状态下微生物群落的真实情况。2.非培养（Culture-independent）方法至今所鉴定的植物内生菌大多数是依靠传统的可培养方法分离的，由于对许多微生物的生长条件尚未知晓，受培养基选择限制，可培养的菌株只是其中一小部分，而有相当一部分菌株处于存活但不可培养的状态。近几年，以16SrDNA基因作为系统发育标记，利用非培养方法检测微生物种群的技术，克服了传统培养方法的欠缺，为检测微生物种群多样性提供了更为有效的手段。经过多年的研究，目前，已发展起来应用于土壤、海洋、植物内生菌研究的非培养方法包括以生物化学为基础的非培养方法，如磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）图谱分析方法、脂肪酸甲酯（fattyacidmethylesters，FAME）图谱分析方法等；基于生理学的方法-Biolog微量分析；基于杂交技术的方法-荧光原位杂交（FISH）；但运用最多的是基于PCR反应，在此基础上进行各种分析。主要的分析技术有变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE）、扩增rDNA限制性分析（AmplifiedRibosomalDNARestricitionAnalysis，ARDRA）、温度梯度凝胶电泳（TemperatureGragmentGelElectrophoresis，TGGE）、末端限制性片段长度多态性（TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism，T-RFLP）、单链构象多态性分析（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）、限制性片段长度多样性（RestrictFragmentLengthPolymorphism，RFLP）等。目前，这些方法与技术，结合蛋白质组学、基因组学的方法与技术，如功能基因分析、酶活性测定等，不仅可以开展自然环境未培养微生物群落的多样性及其群落结构的研究，而且能够揭示自然生态系统的结构、功能及其相互关系，即可以直接通过基因组序列及其基因产物，分析或预测未培养微生物的系统发育关系、生理生化反应及其代谢途径等，而无须首先获得纯培养。2.1生物化学方法的代表-磷脂酸法（PLFA）PLFA存在于细胞膜中，由于不同的微生物具有不同的PLFA种类和数量，因此，可以作为了解自然环境中微生物种类组成和数量变化的指标。但PLFA模式并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅有群落结构的概图。在有的情况下，某种PLFA的浓度改变与某些特异的微生物类群的改变密切相关。PLFA的分析结果又时要结合生态因子进行综合评价，才能获得准确的信息。此方法主要应用于微生物群落动态变化的定量分析，虽然能够快速有效地从环境样品中提取大部分脂肪酸，但只能鉴别到属的水平，且受人为因素干扰强烈。2.2生理学方法的代表-Biolog微量分析Biolog微量板分析系统是由Biolog公司开发，用来测定微生物为95种碳源的利用情况并据此来对话能异样细菌进行鉴定的系统。Biolog依据的原理很简单，在分析板上有96个孔，其中，有一个孔不含有任何碳源作为对照，其余95个孔每孔含有以种碳源和氧化还原染料四氮哇蓝。底物利用产生的氧化还原电势的变化可导致染料的颜色发生变化，变化的速率和程度代表了底物被利用的速率和程度。微生物群落结构不同，95个孔的颜色变化方式就不同，这样可以知道不同样点位生物区系的差异。如Garland等[13]首先报道了这种碳源利用信息可把一种不同种类的土壤和水体微生物区系区别开。Zak等[14]把这种系统作为一种定量方法，用来评价与6种植物区系相关的微生物的功能多样性。但是，由于不同微生物对同一碳源的利用能力是有差异的，所以微生物对不同单一碳源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异；而且土壤微生物在Biolog系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对碳底物实际利用能力的改变，使得Biolog方法在准确性方面受到一定限制。但Biolog方法因快速、简便而受到人们的欢迎。2.3基于杂交技术的方法-荧光原位杂交（FISH）荧光原位杂交技术是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术，其原理是dsDNA变性后和带有互补序列的同源单链退火配对形成双链结构的过程。退火复性形成的可以是DNA/DNA或DNA/RNA异质双链扽子，带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，探测其中所有的同源核酸序列，结果可直接在共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜下进行，无须单独分离DNA或RNA，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样品进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据，荧光原位杂交技术近几年也已经成为微生物生态学研究的热点。由于其灵敏、快速、使用安全、特异性好等特点，被用于分析复杂环境的微生物群落结构，是一种监测和定量分析复杂的环境样品中微生物群落动态的有效方法，也为人工创建生物处理系统的最佳条件提供了理论依据。在微生物多样性的研究中大多以荧光染料标记的16SrDNA和16SrRNA挂核苷酸序列作为探针，按照2个核酸的碱基序列互补原则，将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，由于与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，能激发杂交探针的荧光信号，通过荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列进行定位、定性和相对定量分析，就能实现原位样品中的目标细菌的探测。此技术包括如下步骤：样品定位、样品的制备与预处理、预杂交、探针和样品的变性、杂交、漂洗和检测信号等。2.4基于PCR的研究方法2.4.1变性梯度凝胶电泳（DGGE）变性梯度凝胶电泳（DGGE）的原理是使用一对特异性引物PCR扩增微生物自然群体的16SrRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物，然后用DGGE分离产物混合物。DGGE胶是在6%聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，在一定温度及同一浓度变性剂的条件下，序列不同的产物，其解链程度也不同，而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上分离开来。在引物的5’端加上40个碱基左右的G-C串可使DGGE对序列差异的分辨率提高近1倍，所以，DGGE方法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析等。但是PCR扩增过程中可能存在碱基插入的错误、不同微生物细胞破壁难易的不同等而造成的分析结果的偏差。PCR-DGGE的操作过程：①核酸DNA的提取；②PCR扩增：根据所选16SrDNA变异区两边的保守区设计特异性的引物（其中一条引物的5’端加40bp左右的GC夹子），设计程序时最后可以使用降落PCR从而进一步减少非特异性扩增；③DGGE；④Electrobloting；⑤杂交分析或者在完成DGGE后可以对分离的胶进行回收，然后，再进行二次PCR（用不加GC夹子的引物），将产物回收与T载体连接，转化到DH5a，然后，进行酶切验证并将阳性克隆送到相关公司完成测序。PCR-DGGE的优点：①不需要培养：直接从所研究的样品中提取总DNA，然后对16SrRNA的可变区进行PCR扩增，扩增产物通过变性梯度凝胶电泳（DGGE）进行分析，能检测到难以培养或不能培养的微生物，由此发现一些原来没有检测到的新的微生物种类；②检测极限低大约为1%~3%，如果结合使用rRNA杂交技术，还可使检测极限降至0.1%左右；③检测速度快、经济；④结果准确可靠：传统的生化鉴定方法虽然也能对细菌进行鉴定，但会出现假阳性或假阴性结果，主观性比较强，而且会漏掉一些不能培养的微生物；⑤同时检测多种微生物：DGGE凝胶上至少可以区分10个清晰可辨的条带，而每个条带可能来自不同的微生物；⑥与其他方法结合：DGGE可以和许多方法结合，从而全面认识微生态的组成、优势菌群等。2.4.2温度梯度凝胶电泳（TGGE）温度梯度凝胶电泳（TGGE）的原理与变性梯度凝胶电泳（DGGE）类似，除了利用核酸分子的大小和带电荷数的多少以外，还利用了核酸分子的分子构象。稳定的构象由氢键和范德华力共同维系，并受环境温度、盐离子浓度、pH值等因素影响，如果环境温度升高到某一限定点就可以破坏氢键和范德华力，这时分子即处于变性状态，此过程就称为热变性，TGGE就是利用不同构象的分子具有不同的变性温度（Tm）来进行分离的。在正常情况下，经过PCR的16SrDNA分子呈双链结构状态；当温度升高到一定值时，16SrDNA双链开始解开，由完整的双链变成分叉双链；如果温度继续升高，rDNA双链完全解开，变为单链rDNA。这种分子构象的改变会影响分子在电泳时的迁移行为，因为rDNA双链的打开直接导致迁移率下降。这种影响在两条链即将完全解开时最大，此时分子的电泳速度最慢；而当全部形成单链时，泳动速度又会变快。利用这一特点，TGGE就可以在聚丙烯酰胺凝胶上得到所分析样品的遗传指纹图谱。

2.4.3限制性片段长度多态性（RFLP）分析限制性片段长度多态性（RFLP）是一种DNA分子水平上的多态性检测技术，它是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用。该技术已广泛用于微生物群落的研究。PCR-RFLP可以检测出碱基发生突变、插入、缺失的位点。限制性内切酶能识别并切割特异性核苷酸序列。由于不同来源的DNA具有不同的限制性内切酶酶切位点的分布，每一种DNA限制性酶组合所产生的片段是特异的，从而产生多态性，所以它能作为某一DNA的特有指纹。切割产生的不同片段通过特定探针杂交进行检测，从而可比较出不同品种的DNA水平的差异（即多样性）。多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系，该方法检测结果不受环境因素的影响。但是该技术所用限制酶的选择通常凭经验，正常情况下必须使用多种酶。因为一种酶可能在两种DNA片段的同一位置进行切割。为了克服RFLP技术上的缺陷，将PCR技术和荧光标记技术结合，发展出了核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析（ARDRA）技术及末端限制酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）技术。目前，在环境微生物群落研究中，PCR-RFLP主要用于微生物的16SrDNA，根据16SrDNA序列的限制性片段长度多态性，以此确定群落的微生物多样性和种群的遗传多样性。2.4.4单链构象多态性（SSCP）分析单链构想多态性（SSCP）是利用保守区的序列作为引物，以PCR进行扩增，将扩增的DNA片段变性，使其解链成为单链DNA，在一定条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，DNA上微小的碱基差异即可形成不同的DNA构象，在凝胶上的迁移率亦不同，反映出单链DNA片段的多态性。其基本过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。近年来该方法除了大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变外还应用于微生物生态研究，在微生物菌群多样性的研究中，SSCP是与16SrDNA技术结合，对16SrRNA基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。SSCP特点：设备简单，无需专门的电泳设备；无需带有GC夹子和荧光标记物；后续研究易进行，当研究特异类群的动态变化时，可采用该类群的特异探针与SSCP图谱进行杂交，进而显示该类群的演替及在群落中的位置。但是SSCP技术重现性较差，易受胶浓度和电泳温度等条件的影响，另外，SSCP能够有效分离的DNA序列过段短（150~400bp）。第四节拮抗微生物在生物农药创制中的应用

微生物容易人工控制培养条件，繁殖周期短，繁殖系数大，有效产量高，特别是可以通过育种手段改造菌种，使之便于组织工业化生产。拮抗菌的研究开辟了微生物应用研究的新领域，目前工作的重点是筛选能产生高活性抑菌次生代谢产物的菌株，经育种改造菌株或改进工艺，利用其生产药物。1.

首先，筛选产抗菌活性物质拮抗菌株应遵循一定的策略，避免筛选的盲目性。我们应考虑筛选材料的有关背景。如利用植物内生菌筛选活性菌株，要注意植物的生长环境、植物的特殊分布、植物种的年代、抗病抗虫性以及药用背景等。植物的生长环境直接影响内生菌的生物多样性，而植物种植的年代也直接影响其生物多样性、抗病虫性，年代越久远，其内生菌的生物多样性越丰富；抗病和抗虫性越强的植物，其所含的内生菌具有抗菌和杀虫活性的可能性就越大；具有药用性能的植物，其所含的内生菌有可能产生植物相同或相似的活性物质。2.其次，应选择适宜的培养基及摸索合理的培养条件。有合适的培养基，就能培养出分离到的菌株，从而筛选到目标菌株。3.最后，发酵液中活性物质的提取分离手段。值得一提的是，目前采用的通常是经典的生物化学提取分离方法与现代技术相结合，既运用了传统的溶剂提取、柱层析分离的方法，又运用了正反相分离、高效液相色谱（HPLC）制备、高速逆流色谱（HSCCC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等现代技术手段分离纯化次生代谢产物，利用光谱分析手段，包括紫外光（UV）、红外线（IR）、核磁共振（NMR）、质谱（MS）、X射线（X-Ray）对化合物进行结构鉴定。

我国幅员辽阔，具有丰富的微生物资源。如药用植物资源的利用在我国具有悠久的历史，有记载的药用植物就有5000多种，包括许多具有抗菌和杀虫活性的植物。因此，利用我国的微生物资源筛选抗菌和杀虫活性物质，对促进新型生物农药的开发和创制具有十分重要的意义。此外，从微生物中寻找发现新型先导化合物，也是新农药研制的重要途径。第五节抑菌土

抑病性土壤是健康的土壤。土壤健康是指在生态系统界限内维持生物生产力、环境质量和促进植物、动物健康的土壤功能的运行能力。多年来，人们已经对一些重大的植物病害的土壤抑病性进行了研究，并且揭示了土壤抑病性的形成机制是不同的，主要分为普遍抑病性和特殊抑病性两种机制。普遍抑病性是指土壤中微生物群体对某种病原菌具有很强的拮抗性，而特殊抑病性则是指土壤中某类微生物对某种病原菌生活史的特定阶段具有拮抗作用。一、概念

1.土壤抑菌作用（fungistasis）：指土壤中或同土壤相接触的微生物繁殖体的萌发受到抑制的现象。抑菌作用对细菌、放线菌、真菌都存在，但以真菌最为敏感。Dobbs和Hinson在1953年最早提出了土壤抑菌作用概念。土壤抑菌作用可以使真菌孢子在土壤中保持休眠状态而存活更长时间。说明土壤抑菌作用可能是土传病害生防菌剂防效不稳定的重要原因之一。2.抑病土（Suppressivesoils）：包括所有不利于病害发展的土壤。狭义来讲，它们是指那种病害发生程度自然降低的土壤。与那些由单一种植某种作物品种而引起的病害降低有明显的区别。在抑病土中，即使有病原和感病寄主存在，病原接种体密度大，病害的严重程度也会受到限制，病害也不发展。对于土传病害生防菌，要求它能够在土壤和植物根部定殖及扩增，这就需要克服和解除土壤对生防菌的抑菌作用。土壤由感病状态转化为抑病状态。抑病土中即使长期不种植作物，其抑制作用仍是存在的。3.导病土（Conducivesoils）指利于病害发展的土壤，也称为利病土。在导病土中，在病原接种体密度相对低的情况下，病害也能严重发生。土壤平板法直接测定土样对生防菌孢子的抑菌作用，不同土样普遍存在土壤抑菌作用，且土样间和菌株抑菌作用有差异。只有当感病作物和病原物同时存在时抑病土才能被鉴定。二、研究史-1892年Atkins首次开展了棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum)抑病土的研究。–1933年walker发现了豌豆萎蔫病的抑病土。–1934年Fellow和Glynw分别在美国和英国发现小麦全蚀病的抑病土。

–1968年Gerlagh在荷兰验证了小麦金蚀病抑病土存在，同时说明了小麦连作可使部分病田土壤转变为抑病土。

–20世纪70年代以来研究报道不断增加，1974年baker和cook进一步证实麦田土壤对小麦全蚀病菌产生抑制性，病害随着连作逐渐衰退。–1982年Huber报道15种土传病原引起的30余种病害被抑制的情况，包括抑病土的类型及与抑病有关的因素。

三、特性1.抑病土具有一定的抑菌范围抑病土对不同病原微生物的抑制性不同，每一种抑病土都有其自身的抑菌范围。例如，在美国夏威夷岛，华丽腐霉Pythiumsplendens的抑病土可抑制P.splendens，瓜果腐霉P.aphanidermatum）但不能抑制橡胶树疫霉Phytopgthorapalmivora，辣椒疫霉P.capsici。2.pH值对抑病土的影响调节土壤的pH值可使一些抑病土丧失其抑病。在台湾，P.capsici抑病土的pH值由4调整到5或6时，则失去抑病性；反之，导病土的pH值由5调整到4，并不会抑制P.capsici孢子囊发芽。3.土壤营养物质对抑病土的影响十字花科蔬菜根瘤菌抑病土的抑病性与土壤含钙量密切相关。Ca(OH)2、Ca(NO3)2·4H2O、CaCO3、CaSO4、K2HPO4则具有抑制镰刀菌厚垣孢子发芽和促进芽管坏死的显著作用。在土壤中加水苔、青萍和龙眼种子粉可使西瓜蔓割病菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）厚垣孢子的芽管大量坏死。棉花枯萎病菌抑菌性土壤施入不同形式的有机肥后，抑菌性发生了变化。–施入马粪后，抑菌性被削弱，枯萎病菌增殖加快，棉花枯萎病发病率与导菌土相当。

–施入棉子饼及豆饼之后则抑菌性增强，抑菌效果增加，尖胞镰刀菌萎蔫专化型的增殖受到抑制，而非致病性镰刀菌及产荧光假单胞菌含量增加。水苔是一种天然的苔藓，又名泥炭藓(HerbaSphagni)，为泥炭藓科植物。苔藓植物是一种小形的绿色植物，结构简单，仅包含茎和叶两部分，有时只有扁平的叶状体，没有真正的根和维管束。中国大部地区山地均有分布。苔藓植物喜欢阴暗潮湿的环境，一般生长在裸露的石壁上，或潮湿的森林和沼泽地。广泛用于各种兰花的栽培，是种植栽培基质上等材料之一。青萍，水生植物。浮萍的别称。用途全草入药，发汗，利尿，消肿。可作饲料。4.抑病性的可传递性微生物因子引致的抑病性具有可传递。P.splendens的利病土中分别加入10％、25％、50％、75％的抑病土，病菌孢子萌发率随着加入抑病土量增加而减少。说明抑病性是可以传递的。将一部分抑病土和经高温处理的利病土混合后，就可以获得抑病作用。连续稀释后，即使只加入1mg/kg的抑病土，抑制作用也是有效的。将泥炭土中加入10%的抑病土，获得的抑病作用就与原来的抑病土相似，当抑病土的体积占总体积的2%，甚至是1%时，抑制作用仍是有效的。在温室条件下种植番茄只加入8%的抑病土，对镰刀菌枯萎病的有效控制就可达3年之久。四、作用机理（一）土壤非生物因素的作用1.特定的土壤类型和特定的病害之间存在明显的联系。

棉花镰刀菌萎蔫病的的严重度随土壤类型不同而不同。豌豆镰刀菌萎蔫病的传播，沙土比结构好的土壤传播的快。香蕉枯萎病的抑病土与粘土有关。沙土利于镰刀菌枯萎病的侵