DB21-T 3005-2018牛冷冻精液质量检测技术规程

ICS65.020.30

B43

备案号：61299-2019DB21

辽宁省地方标准

DB21/T3005—2018

牛冷冻精液质量检测技术规程

Technicalspecificationonqualitytestsforbovinefrozensemen

DB21/T3005—2018

牛冷冻精液质量检测技术规程

1范围

本标准规定了牛冷冻精液质量检测的冷冻精液剂量、精子活力、前向运动精子数、精子畸型率、细

菌数等检测技术内容。

本标准适用于牛冷冻精液的质量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4143-2008牛冷冻精液

NY/T1234-2006牛冷冻精液生产技术规程

3剂量检测

3.1主要器材

5.0mL小试管、试管架、细管剪、1.0mL刻度吸管、捡卵器、细管精液专用推针。

3.2检测方法

随机抽取3支细管冻精自然解冻后剪去超声波封口端，用细管精液专用推针把精液逐一推入1个

5.0mL小试管内。用乳胶管将1.0mL刻度吸管与捡卵器联接紧密后，吸尽5.0mL小试管内的精液，并准确

读取其精液量。

3.3计算

3支细管冻精精液量的平均值为该样品的剂量值。及时记录检测结果，牛冷冻精液剂量记录表参照

附表A.1。

N

Q

3.........................................(1)

式中：

Q——剂量值，单位为mL；

N——3支样品精液量，单位为mL。

4精子活力检测

4.1主要器材

1

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相差显微镜或相差显微摄像系统、恒温载物台、玻片加热台、恒温水浴箱、5.0mL小试管、试管架、

载玻片（76mm×25.4mm）或精液性状板、盖玻片、细管剪、10µL移液器、移液器枪头、吸水纸。

4.2检测方法

取3支细管冻精置于37℃水浴中解冻，取出细管用吸水纸擦干，用细管剪剪去超声波封口端，用细

管精液专用推针把精液逐一推入5.0mL试管内，轻轻摇晃混匀。用移液器取精液5µL置于载玻片的一端，

另取5µL置于载玻片的另一端，盖上经在恒温载物台上预热至38℃的盖玻片，制成2个样片后，立即置于

38℃载物台上，在100倍或200倍相差显微镜下观察活力，也可通过相差显微系统在显示屏上观察活力。

每个样片观察3个视野，分别得出2个样片活力。

4.3计算

2个样片活力的平均值为该样品的活力值。及时记录检测结果，牛冷冻精液精子活力检测记录表参

照附表A.2。

nn

n(%)12....................................(2)

2

式中：

n——活力，%；

n1——第1样片活力，%；

n2——第2样片活力，%。

5前向运动精子数检测

5.1主要器材

血球计数板、一次性ZJ-1型20µL定量采血管、1.0mL刻度吸管、5.0mL小试管、捡卵器、血盖片、计

数器、显微镜或显微摄像系统、移液器（20µL、1mL）、3.0%氯化钠溶液。

5.2检测方法

5.2.1用1.0mL刻度细管取0.99mL的3.0%氯化钠溶液注入5.0mL小试管内，将定量采血管与捡卵器

联接紧密，准确吸取10µL精液（可用剂量检测后的样品），注入5.0mL小试管内混匀，使之成为100

倍稀释的稀释精液。

5.2.2用血盖片将血球计数板计数室盖好，用移液器吸取8µL稀释精液于血盖片边缘，使之自行流入

一个计数室，均匀充满，避免有气泡或厚度过大，再用同样方法均匀充满另一个计数室。

5.2.3计数板静置5min（也可放入垫有湿纸的平皿中，以免水分蒸发），先在低倍镜下找到计数室，

然后转换到高倍镜，在显微镜下或电视显示屏上观察计数。计数方法见附录B。

5.3计算

（a）每剂量中精子数（S）=5个中方格中的精子数×5（即计数室25个中方格的总精子数）×10（1cm3

内的精子数）×1000（每mL稀释精液的精子数）×100（细管精液稀释倍数）×剂量值

上式可简化为：

每剂量中精子数（S）=5个中方格精子数×500万×剂量值

2

DB21/T3005—2018

（b）每样品观察上下2个计数室，取平均值，如果2个计数室计数结果误差超过5%，则应重检。

（c）每剂量中呈前向运动精子数按下式计算。及时记录检测结果，每剂量中前向运动精子数检测

记录表参照附表A.3。

CSM......................................(3)

式中：

C——每剂量中前向运动精子数，单位为个；

S——每剂量中精子数，单位为个；

M——精子活力，%。

6精子畸形率检测

6.1主要器材

电子天平、相差显微镜、磨砂载玻片（规格76.2mm×25.4mm、厚度1mm）、凹玻片、血球分类计数

器、玻片架、小吸管、10μL移液器、蒸馏水、染色板、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、碳酸镁、氯

化钠溶液（0.89%）、量筒、试剂瓶（棕色）、三角漏斗、滤纸、记号笔、吹风机等，所用试剂应为AR

级以上。

6.2中性福尔马林固定液的配制

6.2.1在40%甲醛（HCHO）中加入碳酸镁，饱和后用三角漏斗、滤纸过滤。

6.2.2用电子天平称量磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.55g、磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）2.25g，用

浓度为0.89%氯化钠溶液50mL进行溶解，完全溶解后加入8mL饱和的甲醛，再加浓度为0.89%氯化钠溶

液定溶至100mL，倒入试剂瓶中备用。

6.3制片、镜检

6.3.1抹片

用10µL移液器取精液一小滴，滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的凹玻片与有样品的载玻片呈35°

夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干，每个样品制作2个抹片。抹片制作完成后用记号笔作

好标记（品种、牛号）。

6.3.2固定

可采用在已风干的抹片上滴1～2mL中性福尔马林固定液的固定方式，也可采用将风干后的抹片反扣

在染色板上，把固定液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触固定液进行固定的方式。固定

15min后用清水缓缓冲去固定液，用吹风机吹干或自然风干。

6.3.3镜检

将制备好的抹片在200倍显微镜下观察，每个抹片观察200个以上的精子（分左、右两个区），取2

片的平均值，2片的变异系数若大于20%应重新制片。

6.4计算

精子畸形率按下式计算。及时记录检测结果，精子畸形率记录表参照附表A.4。

3

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A

A(%)1100....................................(4)

S

式中：

A——精子畸形率，%；

A1——畸形精子数，单位为个；

S——所查精子总数，单位为个。

7细菌数检测

7.1主要器材

电热恒温培养箱、超净化工作台、电冰箱、电热恒温水浴锅、电子天平、万用电炉、石棉网、三角

烧瓶（容量为250mL）、平皿（直径为90mm）、酒精灯、菌落计数器、细管剪、细管专用推针、棉绳、

脱脂棉、牛皮纸、透气硅胶塞、量筒、称量纸、角匙、记号笔、电热压力蒸汽消毒器、营养琼脂培养基、

75%乙醇。

7.2检测方法

7.2.1营养琼脂的制备

根据检测实际需要量，按所购买的营养琼脂粉使用说明配制适量的营养琼脂，加热煮沸至完全溶解，

经电热压力蒸汽消毒器121℃、15min灭菌后备用。

7.2.2冻精解冻

将样品从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻待用。每一样品解冻2支。

7.2.3将精液注入平皿

在超净工作台内，点燃酒精灯，平皿盖盒面上用记号笔标记上牛号，用酒精棉球擦拭整支细管，将

细管剪在酒精灯上来回烘烤几下后，剪去细管的超声波封口端，用专用推针将整支细管的精液注入灭菌

平皿内。

7.2.4平皿内加入营养琼脂

精液注入平皿后，应及时将50℃±1℃的营养琼脂培养基倒入平皿，每个平皿10～15mL，并转动平

皿使其混合均匀（方法：左3圈、右3圈、前后1个来回）。同时将营养琼脂培养基注入灭菌平皿内作一

空白对照。待琼脂凝固后，翻转平皿，放入37℃恒温培养箱内培养48h±2h。

7.2.5菌落计数方法

做平皿菌落计数时，可在光线较强处用肉眼观察计数，也可以使用菌落计数器计数。

7.2.6平皿菌落数的选择

7.2.6.11个样品使用2个平皿，应采用2个平皿的平均数。若其中1个平皿有较大片状菌落生长时，

则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该样品的菌落数；若片状菌落不到平皿的一半，而其余

一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平皿后乘以2以代表全平皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长

4

DB21/T3005—2018

时（菌落之间无明显界限），若仅有1条链，可视为1个菌落，如果存在不同来源的几条链，则应将每

条链作为1个菌落计。

7.2.6.2当计数平皿内的菌落数超过300个且分布很均匀，可取平皿的1/2或1/4计数，再乘以相应

的2或4作为该平皿的菌落数。

7.2.6.3到达规定培养时间应立即计数，如果不能立即计数，应将平皿放置于2℃～4℃的冰箱内，但

不得超过24h。

7.3计算

1个样品的2个平皿内菌落平均数减空白对照平皿中的菌落数就是该份样品每支细管冻精内的细菌

数。及时记录检测结果，细菌数记录表参照附表A.5。

nn

B12n

20

…………(5)

式中：

B——细菌数，单位为个；

n0——空白对照平皿菌落数，单位为个；

n1——第1个平皿菌落数，单位为个；

n2——第2个平皿菌落数，单位为个。

5

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AA

附录A

（资料性附录）

牛冷冻精液检测原始记录表（样表）

表A.1牛精液剂量记录表

室温（℃）：相对湿度（%）：检测日期：

序号品种牛号外观剂型检测值（mL）剂量值（mL）备注

检测人：复核人：审核人：

表A.2精子活力检测记录表

室温（℃）：相对湿度（%）：检测日期：

第一样片活力第二样片活力平均活力

序号品种牛号备注

（%）（%）（%）

检测人：复核人：审核人：

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表A.3前向运动精子数检测表

室温（℃）：相对湿度（%）：检测日期：

第一计数室5个中方格中的第二计数室5个中方格中的每剂量前向运

序品精子数（个）精子数（个）平均精子总动精子备

牛号

号种小小值数（万数（万注

1234512345

计计个）个）

检测人：复核人：审核人：

表A.4精子畸形率检测表

室温（℃）：相对湿度（%）：检测日期：

第一抹片第二抹片

序品平均精子畸备

牛号精子畸形精子畸形精子畸形精子畸形

号种形率（%）注

总数精子数率（%）总数精子数率（%）

检测人：复核人：审核人：

表A.5细菌数检测表

CB室温（℃）：）：相对湿度（%）：检测日期：

室温（℃）：相对湿度（%）：培养时间（h）：检测日期：

第一平皿菌第二平皿菌平均菌落对照平皿菌细菌数

序号品种牛号备注

落数（个）落数（个）数（个）落数（个）（个）