潏河水中细菌总数和大肠菌群的测定

微生物实验报告2010年12月29日潏河水中细菌总数和大肠菌群的测定——潏河水质检测1、实验目的和原理目的：1．1学习并掌握水中细菌总数和大肠菌群的检测方法。1．2了解国家水质评价的微生物学标准，学会水质检测的方法。原理：水中细菌总数和大肠菌群数是水体是否符合国家水质健康标准常用的两个测定项目。细菌总数是指1ml水样在普通琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数（我国规定自来水1ml细菌总数不得超过100个）。大肠菌群，是以E.coli为代表的，能在37℃、24h~48h内能发酵乳糖产酸、产气的好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这类菌是温血动物肠道中的正常菌群，常随动物的粪便污染水源。它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性，而病原菌在水中浓度很低，测定手续繁琐，因此，大肠菌群是一个合适的指示菌，能指示出病原菌存在在于水中的可能性大小（ 测定水中大肠菌群有多种方法，其中多管发酵法较为常用，测定步骤如下：1）初发酵试验：采用乳糖蛋白胨液体培养基，内倒置一德汉氏小套管。大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气，37℃培养，2）平板分离：采用伊红美兰琼脂平板（EMB培养基），划线接种，37℃培养，分离出带核心的、有金属光泽的、深紫色、紫色或淡紫色的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检，G-无芽孢杆菌者进入复发酵试验3）复发酵试验：以上阳性菌落（发酵乳糖而产酸产气；G-无芽孢杆菌），进入复发酵试验，原理与初发酵试验同。经24h培养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果。以峪河水为研究对象，通过平板菌落计数测定水中细菌总数，同时利用多管发酵法测定总大肠菌群，统计查表检测此处水是否符合细菌学卫生标准。2、实验材料2．1器材类普通光学显微镜、酒精灯、200-1000μl微量移液器、恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、微量移液器、试管、吸耳球、载玻片、量筒、锥形瓶、德汉氏小管、接种环、试管架、移液管、带玻璃塞空瓶、培养皿等2．2试剂类配制培养基所需原料：乳糖、蛋白胨、牛肉膏、2％伊红溶液、0.5％美兰溶液、NaCl、琼脂和溴甲酚紫乙醇溶液革兰氏染色：革兰氏染液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95﹪乙醇、番红复染液）、溴甲酚紫、3.实验过程3.1.样品采集和处理取峪河河中央的水样，取样方法为：将灭菌带玻璃塞的空瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拔开瓶塞，水流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。用报纸将瓶身及瓶塞擦干净，然后重复上步骤取样。在河的上、中下游分别取水样，并标记为1、2、3号。取回的水样暂时放在冰箱中保存。3.2.培养基配制（1）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养基配方：牛肉膏0.6g；蛋白胨2.0g；NaCl1.0g；琼脂3.5g；蒸馏水200ml。将以上成分加热溶解于200ml蒸馏水中，调pH至7.0~7.2（2）乳糖蛋白胨液体培养基培养基的配制：蛋白胨2.5g；牛肉膏0.75g；乳糖1.25g；NaCl1.25g；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加热溶解于250ml蒸馏水中，调pH至7.2~7.4。加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.25ml，充分混匀，分装于有小倒管的试管中。（3）伊红美兰固体培养基（EMB培养基）蛋白胨2.5g；NaCl1.25g；蒸馏水250ml；20％乳糖溶液5ml；2％伊红水溶液5ml；0.5％美兰水溶液2.5ml按上述量将蛋白胨及NaCl按加热溶解于250ml蒸馏水中，调pH至7.6，冷却至60℃左右时，再把乳糖溶液、伊红水溶液及美兰水溶液按上述量加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，115℃33.3.实验流程（1）水中细菌总数的测定（用水样1测定）1）稀释水样：取3个灭菌试管，编号1、2和3，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入1号管内，摇匀，再自1号管取1ml加入2号管内，如此稀释到第三管，稀释度分别为：10-1、10-2和10-3。2）自三个试管中各取1ml稀释水样，加入灭菌培养皿中，每一稀释度做3个培养皿。3）各倾注15ml已融化并冷却至45℃4）培养基凝固后，37℃5）计数得出该水样中的细菌总数。（2）.多管发酵法检测水中总大肠菌群（共三个水样）1）水样稀释：取两个灭菌试管，标号1、2、3，分别加入9ml无菌水。用移液管取1ml原水样加入1号管中，摇匀。再从1号管中取1ml加入2号管中，如此稀释到第三管，稀释度分别为：10-1、10-2和10-3。2）初发酵试验表2污水样（ml）培养基（ml）1（10-3）5（普通浓度乳糖蛋白胨发酵试管）1（10-2）5（同上）1（10-1）5（同上）1（原样）5（同上）用注射器将乳糖蛋白胨培养基灌满德汉氏小套管倒置放入发酵管中，115℃灭菌30min，再按表2加水样。后放在373）平板分离和革兰氏染色：将24h内产酸产气的和48内后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，于37℃恒温培养24h，刮取深紫黑色、有金属光泽或紫黑色、不带或略带金属光泽或淡紫色、中心颜色深的菌落的一小部分进行涂片-革兰氏染色-镜检。镜检结果革兰氏阴性、且无芽胞杆菌,4）复发酵试验：挑取革兰氏阴性且无芽孢杆菌菌落另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，37℃根据确证的初发酵实验阳性管数目查表，得到每升水样中大肠菌群的数目。4.实验结果4．1细菌总数的测定结果表3细菌总数的测定稀释度10-110-210-3重复测定重复重复测定123123123菌落数97000120000140000980089009200163016001200平均菌落数11900093001480细菌总数120004.2大肠菌群数测定结果*表4大肠菌群数测定结果*实验步骤现象重复水样接种量（ml）1（原液）1（10-1）1（10-2）1（10-3）初发酵试验24h产酸产气1++++2++--3++--48h产酸产气12--3--平板分离鉴定G染色及芽孢1++++2-+3++复发酵试验24h产酸产气1++++2+3++*：+表示阳性；－表示阴性。表5各水样发酵结果稀释度1（原样）10-110-210-31号水样++++2号水样-+--3号水样++--根据各水样发酵结果查表XIII-6总大肠菌群检数表得水样123每升水样中总大肠菌群>238009402205.分析讨论实验做了两次，第一次是把水样以中度污染的程度设计的实验，结果平板分离时的阳性菌落太多以至实验失败，这次是以严重污染程度设计的实验；从实验结果可以看出水样1的大肠菌含量超过了严重污染的指标，水样2和水样3的大肠菌含量要低很多。造成这显著的差异的原因：（1）水样1是在潏河比较下游的河段取得样，而水样2、水样3则是在中上游取得样（2）从潏河中游到下游的河道周围遍布村庄，那些生活污水都往河里排，尤其是人畜粪便这种大肠菌含量极高的污染物也大量往河里面排，大肠菌的含量大大增加6.结论（1）潏河水的大肠菌污染现象