酶工程复习资料

/第一章绪论★1、酶与酶工程定义酶：具有生物催化功能的生物大分子。酶工程：酶的生产与应用的技术过程。★2、酶的分类与命名原则（图见书P3酶的分类）一、蛋白类酶的分类与命名1、习惯命名法1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为习惯名。主要依据原则：（1）根据酶作用的底物命名；淀粉酶、蛋白酶（2）根据酶催化反应的性质及类型命名；有的酶结合上述两个原则来命名。脱氢酶、谷丙转氨酶（3）来源：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶习惯命名比较简单，应用历史较长，尽管缺乏系统性，但现在还被人们使用。2、国际系统命名法国际系统命名法原则是以酶的整体反应为基础的，规定每种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两个底物起反应，应在它们系统名称中包括两个底物的名称，并以“：”号将它们隔开。若底物之一是水时，可将水略去不写。3、国际系统分类法及酶的编号1961年国际酶学委员会（EnzymeCommission,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶，分别用1、2、3、4、5、6表示。每一个酶的分类编号由4个数字组成，数字间由“·”隔开，编号之前冠以EC（EnzymeCommission)。乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号(1)氧化-还原酶氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸脱氢酶苯丙氨酸氧化酶，催化苯丙氨酸→酪氨酸。如儿童缺乏苯丙氨酸氧化酶，则苯丙氨酸→苯丙酮酸。苯丙酮酸随血液进入大脑，损害大脑发育，儿童称为弱智——苯丙酮尿症。(2)转移酶转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(3)水解酶水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(4)裂合酶裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(5)异构酶异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(6)合成酶合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===A¾B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2®草酰乙酸二、核酸类酶的分类与命名1、分子内催化R酶：催化本身RNA分子的核酸类酶★自我剪切型：在一定条件下催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶。RNA前体→成熟的RNA+RNA片段例：T4噬菌体前体、丁型肝炎病毒RNA前体等。★自我剪接型：在一定条件下催化本身RNA分子进行剪切和连接反应的R酶。含Ⅰ型IVS的R酶：与四膜虫rRNA前体的IVS结构相似，催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。含Ⅱ型IVS的R酶：与细胞核mRNA前体中的IVS相似，催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+。2、分子间催化R酶催化其他分子进行反应的核酸类酶。RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪接酶、多功能R酶酶活力概念酶活力的大小可以用一定条件下酶所催化的反应初速度表示。在外界条件相同的情况下，反应初速度越大，意味着酶活力越高。固定化酶活力的常用测定方法及注意点（P10见书上）第二章酶生物合成的基本理论★酶的生产方法1、提取分离法定义：采用各种技术从动植物或微生物细胞中将酶提取出来，再与所含杂质进行分离的技术过程。优点：设备简单，操作方便缺点：原料的周期长，来源有限，并受地理气候和季节等因素的影响，受经济、技术及伦理各方面的限制。2、生物合成法：最广泛使用的方法定义：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、动植物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。分类：微生物发酵产酶（应用最广）、植物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶优点：生产周期短，酶的产率高，不受生物资源、地理环境和气候条件等影响。缺点：对发酵设备和工艺条件要求高。3、化学合成法定义：按照酶的化学结构中氨基酸或核苷酸的排列顺序，通过化学反应将一个一个的单体（氨基酸或核苷酸）连接起来而获得所需酶的技术过程。缺点：反应步骤多，只适于短肽，受试剂、设备和成本等因素限制。只合成化学结构十分清楚的少数酶转录的基本过程：（转入的起始、RNA链的延伸和RNA链合成的终止）转录以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。转录过程的特点转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。（反义链，有义链）反义链antisensestrand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链codingstrand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。原核生物：核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。真核生物：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification蛋白质的合成过程（P25）1、氨基酸的活化与转运氨酰-tRNA合成酶AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA+AMP+PPi对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。酶生物合成的调节（P29）适应酶：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。★分解代谢物阻遏作用（原核生物酶简述分解代谢物阻遏作用的原理及解除方法）分解代谢物阻遏作用是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。原理：释放能量葡萄糖等物质分解代谢ATP↑、AMP↓细胞内的cAMP通过磷酸二酯酶水解生成AMP腺苷酸环化酶活化受到抑制cAMP的生成受阻胞内cAMP↓cAMP-CAP复合物↓启动基因位点上没有足够的cAMP-CAP复合物RNA聚合酶无法结合在启动基因位点上转录无法进行，酶合成受阻细胞生长、新陈代谢进行ATP↓ADP↑、AMP↑、cAMP↑cAMP-CAP复合物结合到启动基因的特定位点RNA聚合酶结合到相应位点酶生物合成开始解除方法：为了减少或解除分解代谢物阻遏作用，可以在培养环境中控制好某些容易降解物质的量或添加一定量的cAMP。★酶生物合成的诱导作用（什么是酶合成的诱导作用？其原理是什么？）酶生物合成的诱导作用是指加入某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象。原理？？★酶生物合成的反馈阻遏作用（什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？其原理？）酶生物合成的反馈阻遏作用有称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。原理？★端粒酶(P33)是催化端粒合成和延伸的酶。端粒酶是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。★抗体酶（P34）又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。第三章酶的生物合成法生产（为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？）★产酶工艺条件及其调节控制（见P46-47看下）一、细胞活化与扩大培养将保藏的细胞接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复的过程。条件：适合细胞生长、繁殖的最适条件时间控制：培养到细胞对数生长期为宜二、pH的调节控制三、温度的调节控制四、溶解氧的调节控制★微生物发酵产酶的方式及特点（P49）1、固体培养发酵：设备简单、操作方便；劳动强度大、原料利用率低、生产周期长。2、液体深层发酵：酶发酵生产的主要方式3、固定化细胞发酵4、固定化原生质体发酵★简述提高酶产量的措施？1、添加诱导物能使某些酶的生物合成开始或加速进行的物质。酶的作用底物：大肠杆菌在含乳糖的培养基中能大量合成β-半乳糖苷酶酶的反应产物酶作用底物的类似物进一步研究和开发廉价的诱导物具有重要的意义和应用前景2、控制阻遏物的浓度阻遏物：能够引起某些酶的生物合成停止或减速进行的物质产物阻遏：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏：有分解代谢物（如葡萄糖或其他容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制碳源浓度、添加一定量的环腺苷酸可以解除（减少）分解代谢物阻遏3、添加表面活性剂细胞膜高度的选择透性表面活性剂》增加细胞的透过性——》利于胞外酶分泌——》酶产量↑4、添加产酶促进剂发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响的学科。★酶生物合成的模式及特点细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：是酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种生物合成模式。特点：酶的生物合成不受分解代谢物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用，而且酶所对应的mRNA很不稳定。延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成的一种生物合成模式。特点：酶的生物合成受分解代谢物的阻遏作用，而且酶所对应的mRNA相当稳定。中期合成型：酶的生物合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止的一种合成模式。特点：酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而且酶所对应的mRNA稳定性差。滞后合成型：酶的生物合成在细胞生长进入平衡期以后才开始并大量积累的一种合成模式。特点：酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用，而且酶所对应的mRNA稳定性很好。★产酶动力学（P57）主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。固定化细胞发酵产酶的特点（P58-59）1、提高产酶率；2、可以反复使用或连续使用较长时间；3、稳定性好；4、缩短发酵周期，提高设备利用率；5、产品容易分离纯化；6、适用于胞外酶等胞外产物的生产第四章酶的提取与分离纯化细胞破碎方法：机械破碎、物理破碎、化学破碎、酶促破碎机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法★物理破碎（P74）通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎温度差破碎法；压力差破碎法；超声波破碎法★酶的提取（概念及注意事项）概念：酶的提取即酶的抽提，是指在一定的条件下，用适当的溶剂（或溶液）处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂（或溶液的）中的过程。抽提原则：根据酶的结构和溶解特性，选择适当的溶剂。极性物质易溶于极性溶剂中；非极性物质易溶于非极性有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中；碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。影响酶提取的主要因素温度适当提高→酶溶解度↑，扩散速度↑→提取效果↑；过度提高→酶失活有机溶剂提取时：应控制温度在0~10℃pH影响酶的溶解度和稳定性提取液的体积提取液的总量一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提取。★等电点沉淀法79原理：两性电解质在等电点时溶解度最低；不同的两性电解质有有不同的等电点。缺点：沉淀不完全。因为等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全。注意：调节pH时，防止局部过酸或过碱。★有机溶剂沉淀法80有机溶剂使酶沉淀析出的原因：1、有机溶剂的存在使溶液的介电常数降低，从而使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。2、有机溶剂与水作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。操作注意：有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍；pH一般调到欲分离酶的等电点附近；一般在低温条件下操作。凝胶电泳（P104）？？聚丙烯凝胶电泳（为什么SDS-凝胶电泳不受蛋白分子电荷及分子形状影响？）P106（1）连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的pH和相同的缓冲液进行的电泳。（2）不连续凝胶电泳：采用2层或3层性质不同的凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）重叠起来使用，采用两种不同的pH和不同的缓冲液进行的电泳。第五章酶改性的基本理论★酶的改性：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程P123（酶的辅助因子）1、无机辅助因子Mg2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+,Mn2+,Ca2+等金属离子。2、有机辅助因子：分子量较小的有机化合物；在酶催化过程中起着传递电子、原子和基团的作用。P124（1）烟酰胺核苷酸维生素B5，也叫维生素PP，抗赖皮病维生素，是吡啶的衍生物，有两种：烟酸（尼克酸，nicotinicacid）烟酰胺（尼克酰胺，nicotinamide），体内多以烟酰胺形式存在，性质稳定。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，即辅酶Ⅰ）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，即辅酶Ⅱ）是维生素B5的衍生物。在脱氢酶的催化过程中参与传递氢。氧化型：NAD+，NADP+还原型：NADH+H+，NADPH+H+（2）黄素核苷酸核黄素（VB2），是6,7-二甲基异咯嗪和核糖醇结合而成的化合物。核黄素的衍生物与磷酸结合成黄素单核苷酸（FMN）；FMN与一分子AMP缩合，形成黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。氧化型：FMN、FAD还原型：FMNH2、FADH2黄酶（黄素蛋白）的辅酶，参与氧化还原反应氢原子传递（3）铁卟啉过氧化氢酶、过氧化物酶等氧化酶的辅助因子。通过共价键与酶蛋白结合牢固，起传递电子的作用。（4）硫辛酸（6,8-二硫辛酸）氧化还原酶催化作用中：传递氢；酮酸的氧化脱羧反应中：酰基传递作用。（5）核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTP磷酸转移酶的辅助因子。GTP：还是含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的辅助因子。（6）鸟苷含Ⅰ型IVS的自我剪接酶的辅助因子（7）辅酶Q是一系列苯醌衍生物，为一些氧化还原酶的辅助因子。短侧链的辅酶Q：主要存在于微生物中；长侧链的辅酶Q10：存在于哺乳动物中。（8）谷胱甘肽（G-SH）L-谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸组成的三肽，是一些氧化还原酶的辅助因子。（9）辅酶A3’-磷酸腺苷-5’-焦磷酸-泛酸-β-巯基乙胺泛酸（VB3），由α,γ-二羟基-β,β-二甲基丁酸和β-丙氨酸脱水缩合而成。（9）辅酶A（CoA）辅酶A是酰基转移酶的辅酶；CoA的巯基可与酰基以高能硫酯键结合，在糖、脂、蛋白质代谢中起传递酰基的作用。作为酰基载体蛋白的辅基，参与脂肪酸合成的代谢；辅酶A对厌食、疲劳等症状有明显的改善效果。（10）生物素（VB7、VH）由噻吩环和尿素结合而成，侧链有一个戊酸，有α,β两种异构体.是羧化酶的辅酶，比如丙酮酸羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶，参与CO2的固定和羧化作用。（11）硫胺素焦磷酸（TPP）硫胺素（VB1，抗脚气病因子，抗神经炎因子），其衍生物TPP是一个重要的辅酶，由硫胺素焦磷酸化而生成。作为脱羧酶的辅酶——参与α-酮酸的氧化脱羧；作为转酮醇酶的辅酶——参与磷酸戊糖途径；（12）磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺：VB6的衍生物VB6（吡哆素），是吡哆的衍生物，有吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可以作为氨基转移酶、氨基酸脱羧酶和半胱氨酸脱硫酶等的辅酶。★酶蛋白的副键参与连接蛋白质空间结构的副键有：氢键、盐键、二硫键、酯键、疏水键、金属键和范德华力等。盐键是由蛋白质分子中氨基和羧基在一定条件下形成，其结合力较强，是蛋白质空间结构的主要稳定因素之一。★酶的氨基酸残基4类(P133-134)接触残基：直接与底物接触的基团，它们参与底物的化学转变，是活性中心的主要必需基团。包括结合基团和催化基团。辅助残基：既不直接与底物结合，也不催化底物的化学反应，但对接触残基的功能有促进作用。它可促进结合基团对底物的结合，促进催化基团对底物的催化反应。结构残基：是活性中心以外的必需基团，它们与酶的活性不发生直接关系，但它们可稳定酶的分子构象，特别是稳定酶活性中心的构象，非贡献残基：也称为非必需基团。对酶活性的发挥不起作用，可能在系统发育的物种专一性方面、免疫方面或者在体内的运输转移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果没有这些基团，酶的寿命、酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是酶迄今未发现的新的活力类型的活力中心。第六章酶分子修饰★酶分子修饰(P138)酶分子修饰定义:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶分子修饰的意义提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响酶分子修饰的基本要求和条件基本要求：对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。如：（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅助因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等条件：修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例酶分子的主链修饰？？1、定义酶分子主链：肽链或核苷酸链；是酶分子结构的基础。酶分子的主链修饰：利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。2、主链的切断修饰A、主链断裂→酶活性中心破坏→酶催化功能丧失。探测酶活性中心的位置B、主链断裂→酶活性中心的空间结构不变→酶催化功能不变或损失不多，但抗原性发生改变。（肽链有限水解修饰）提高一些酶特别是药用酶的使用价值C、主链断裂→酶活性中心形成→酶分子显示催化功能。酶原分子转换为具有催化活性的酶3、主链连接修饰将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或多种催化活性的修饰方法。多酶融合体：在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶。将两种或两种以上酶的基因融合在一起→融合基因→克隆、表达→多酶融合体。★分子内交联修饰采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。★大分子结合修饰：目前应用最广泛的酶分子修饰方法。采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。修饰剂：水溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、蔗糖聚合物等；用前要活化。作用：提高酶活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶蛋白的抗原性。通过大分子结合修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。（原因）p147★亲和修饰：修饰剂只专一地与酶分子某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或不同中基团都不发生作用的修饰方法。专一性不可逆抑制剂可以分为结合型（Ks型）不可逆抑制剂和催化型（Kcat型）不可逆抑制剂两种。Ks型不可逆抑制剂：根据底物的结构设计的，具有与底物相似的结构。可与酶专一性的结合，同时有一个与酶活性中心的某个必需基团反应的基团，从而对某个必需基团进行修饰。Kcat型不可逆抑制剂：根据酶的催化机制设计的。可以与酶分子结合并被催化。同时还有一个潜在的反应基团可以在酶的催化作用下被活化，活化的基团可与酶活性中心中的基团进行共价结合修饰，从而导致酶的不可逆丧失催化活性。★酶分子的物理修饰（原理、特点）定义：通过各种方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。作用：可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。第七章酶固定化★固定化酶：固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。★包埋法定义：将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法。分类：根据载体的材料和方法的不同分为凝胶包埋法（网格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）1、凝胶包埋法：应用最广泛的固定化方法。定义：以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法。载体：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。注意事项：凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内；不适于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。（1）琼脂凝胶包埋法方法：琼脂→加水加热溶解→冷却至48~55℃→加入酶、细胞或原生质体的悬浮液并迅速搅拌均匀→趁热将混悬液分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中→制的球状固定化胶粒→分离、洗净、备用特点：琼脂凝胶的机械强度差；氧气、底物、产物的扩散较困难。（2）海藻酸钙凝胶包埋法方法：配制一定浓度的海藻酸钠溶液→灭菌→与酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀→将悬液滴加到一定浓度的氯化钙溶液中→制的球状的固定化胶粒。特点：操作简便、条件温和；对细胞无毒性；通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径；磷酸盐会破坏凝胶的结构；一般在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。（3）角叉菜胶包埋法方法：角叉菜胶悬浮于水中→加热溶解、灭菌→冷却至35~55℃→与酶、细胞或原生质体悬浮液混匀→趁热滴到预冷的氯化钾溶液中→制得球状固定化胶粒。特点：制备简便；对细胞和原生质体无毒害；通透性能较好；具有一定的机械强度。（4）明胶包埋法方法：配制一定浓度的明胶悬浮液→加热溶解、灭菌→冷却至35℃以上→与酶、细胞或原生质体悬浮液混匀→冷却制成所需的形状。特点：不适用于蛋白酶及产生蛋白酶的细胞或原生质体的固定化；如机械强度不够，可用戊二醛等双功能试剂交联强化。（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法方法：配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液→与酶、细胞或原生质体悬浮液混匀→加入过硫酸钙及四甲基乙二胺→混合、静止、制得固定化胶粒。特点：所得固定化细胞机械强度高；可通过改变丙烯酰胺的浓度调节凝胶孔径的大小；尽量缩短聚合时间，以减少丙烯酰胺单体对细胞的毒害作用。（6）光交联树脂包埋法方法：选择一定分子量的光交联树脂预聚物→加入1%左右的光敏剂→加水、加热到50℃左右溶解→与酶、细胞或原生质体悬浮液混匀→铺成薄层→紫外光照射3min左右→无菌条件下切成一定的形状。特点：通过选择不同分子量的预聚物可改变树脂孔径；光交联树脂强度高，可连续使用较长时间；短时的紫外照射即可完成固定化，对细胞的生长繁殖和新陈代谢无明显的影响。2、半透膜包埋法定义：将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。载体：聚酰胺膜、火棉胶膜等。适用：底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。方法：将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊中。★结合法定义：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。分类：根据酶与载体结合的化学键不同分为离子键结合法、共价键结合法1、离子键结合法定义：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：某些不溶于水的离子交换剂，如DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶方法：一定条件下，酶与载体混合搅拌几小时，或是将酶液缓缓流过处理好的离子交换柱。特点：结合力较弱，在pH、离子强度等条件改变时，酶容易脱落。使用注意：pH、离子强度、温度等的控制。2、共价键结合法定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。常用载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。特点：结合牢固、酶不会脱落、可连续使用较长时间；载体活化的操作复杂；共价结合可能影响酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。共价键结合法制备固定化酶的“通式”：由于载体上的功能基团与酶分子上的侧链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶联反应前，需先进行载体活化。首先载体上引进活泼基团；然后活化该活泼基团；最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键（关键）载体活化的方法：A、重氮法：需要载体具有芳香族氨基。含苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应→生成重氮盐衍生物，载体引入了活泼的重氮基团→重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应。B、叠氮法含酰肼基团的载体用亚硝酸活化→生成叠氮化合物→叠氮基团与酶分子中的氨基、羟基或巯基等反应。C、溴化氰法含有羟基的载体用溴化氢活化→生成亚氨基碳酸衍生物→在微碱性条件下，亚氨基碳酸基团可与酶分子上的氨基反应。D、烷基化法含羟基的载体用多卤代物进行活化→形成含卤素基团的活化载体→卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应。★固定化酶的特性（问固定化酶稳定性的变化？）则需答出其表现和原因＊一、稳定性§稳定性的表现：1、对热稳定性提高，可以耐受较高的温度。如氨基酰化酶2、保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。3、对蛋白酶的抵抗力增强，不易被蛋白酶水解。4、对变性剂的耐受性提高。§稳定性的原因固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的释放是缓慢的，阻挡不利因素对酶的侵袭。抑制自降解，提高了酶稳定性，限制了酶分子间的相互作用，使酶失去了相互作用的机会。＊最适pHP164§1、载体性质对最适pH的影响载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。载体带正电荷，最适pH向酸性方向移动。影响的原因：因为固定化酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层，扩散层与其周围外部溶液之间存在着Donnan平衡效应。若是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离子（如H+），使其附着于载体表面，导致扩散层的H+浓度比其周围外部溶液高，于是扩散层pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必须向碱侧偏移，才能抵消微环境作用，使固定化酶达到最大效率，因此使用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶高。反之，亦然。§2、产物性质对最适pH的影响表现：产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；产物为碱性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值低；产物为中性时，固定化酶的最适pH一般不改变。原因:扩散限制产物为酸性积聚在固定化酶的催化区域的催化区域内pH降低提高周围反应液碱性pH升高降低的pH，能达到酶所要求的pH葡萄糖氧化酶电极1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。★青霉素酶电极以固定化青霉素酶的酶膜与pH电极结合而成。将青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝胶或光交联树脂膜内，然后紧贴在玻璃(pH)电极上即成。当酶电极浸入含青霉素的溶液中时，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氢离子浓度增加，通过pH电极测出pH值变化，即可测出样品溶液中青霉素的含量。微生物传感器可分为呼吸活性测定型和电极活性测定型两种第八章酶的非水相催化酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。酶的水化过程酶蛋白分子的离子化基团水化过程，水与酶分子表面带电基团结合。此时酶自由度很小，没有表现出催化活性。酶蛋白分子中的极性部分水簇的生长过程，水与酶表面的极性基团结合。酶显示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用较弱的部位。酶活性随着水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被单层水分子覆盖。水分子在活性位点形成的介电屏蔽作用和水分子聚集造成的传质阻力使酶活力降低。结合水：紧紧结合在酶分子表面的少部分水溶剂水：溶解于有机溶剂的游离水必需水（essentialwater）：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。水活度更能准确描述有机介质反应体系中水与酶催化活性之间的关系。水活度（Aw）：在一定的温度和压力下，反应体系中水的摩尔分数χw与水活度系数γw的乘积。即Aw=χw×γw(溶剂的疏水性越大，γw越大）热力学稳定性热稳定性提高；储存稳定性提高；通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低，存在临界水浓度。1、热稳定性提高的原因：酶结构刚性的增强水介质中，酶分子表面的亲水区与水相接触，溶液中的水分子与酶分子中的功能团之间形成氢键，使酶蛋白形成具有柔韧性的开放型空间结构。非水介质中，酶分子的疏水区暴露，酶分子的折叠受到破坏，带电基团之间的相互作用使酶蛋白形成了活性的封闭构象，酶分子的刚性得到增强，对受热而引起的折叠松散的抗性也随之增强。2、热稳定性提高的原因：水含量有限水介质中，随着温度的升高，酶分子表现出折叠及螺旋结构的松散及一种或多种变性反应。无水或含微量水的非水介质中，缺少了足够的水分子参与，那些变性反应受到了有效的抑制。★pH记忆：在有机溶剂中酶的最适pH与水相中酶的最适pH相同，即酶能够记住最后保存其的水溶液的pH。分子记忆：根据分子识别理论，酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象，从而获得与配体类似物结合的能力，这种有配体诱导产生的酶的记忆方法就是分子记忆。大题：1、非水介质中，水对酶的影响？酶催化反应是在环绕着酶分子表面的水层内进行的，所谓非水体系并不是绝对无水的，而是一种含有微量水的有机溶剂体系(水含量≤1％)。在这种体系中，宏观上是有机溶剂，微观上是水体系。酶催化反应时，底物分子须先从有机相进入水相，然后才能与酶形成底物—酶复合物，继而发生反应。酶蛋白质分子表面含有大量带电基团和极性基团，在绝对无水条件下，这些带电基团因相互作用而形成“锁定”的失活构象。加入适量水充当润滑剂，酶分子与水分子之间可形成氢键使酶的柔性增大，维持酶的活性。生物反应体系中的水绝大多数(98％)是作为真正的溶剂水(bulkwate)，而少部分的水紧密结合在酶分子的表面，并被称为结合水(boundwater)。结合水的物理性质如熔点、热容、EPR和IR的光谱特征与溶剂水不同。结合水对酶的结构和催化活性至关重要，因此结合水又被称为结构水(structuralwatert)或称必需水(essentialwater)。据此可以推测若用有机溶剂仅取代溶剂水而不取代结构水，特I不会对酶的活性产生很大影响。1）水对酶的柔性1、酶分子水化无水条件→酶分子的带电基团和极性基团之间通过相互作用形成一种非活性的“封闭”结构→加入水→这种相互作用减弱→“封闭”结构“疏松”→柔韧性增加→以非共价作用力维持酶的催化活性构象。酶活性部位保持一定的柔性是酶表现其催化活性所必需的。2、酶的水化过程酶蛋白分子的离子化基团水化过程，水与酶分子表面带电基团结合。此时酶自由度很小，没有表现出催化活性。酶蛋白分子中的极性部分水簇的生长过程，水与酶表面的极性基团结合。酶显示出活性。水吸附到酶蛋白分子表面相互作用较弱的部位。酶活性随着水含量的增加而增加。酶分子表面完全水化，被单层水分子覆盖。水分子在活性位点形成的介电屏蔽作用和水分子聚集造成的传质阻力使酶活力降低。水参与一些非共价键的形成来维持酶的构象，使酶有一定的柔性，能趋向于最佳催化状态所需的构象变化。但水含量高，酶柔性过大，也会使酶构象改变、失活。有机溶剂中，溶剂无法提供形成多种氢键的能力，甚至还会使酶带电基团之间静电作用加强，使酶刚性增加，活性降低。水含量在最适含量时，酶结构的动力学刚性与热力学稳定性之间达到最好的平衡，酶的活力最大。2)水对酶的稳定性热稳定性提高；储存稳定性提高；通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低，存在临界水浓度。3）水对酶的活力1、水对非水介质中酶活力的影响在有机介质中，酶的最大催化活力都在相同的最佳水活度下，与溶剂的极性无关，而最佳水活度都在0.55左右。对于固定化酶，多数载体不直接影响酶分子与水分子的相互作用2、非水介质中，有机溶剂对酶的影响？在使用不同的酶或者在不同的反应体系中，最适于使用的有机溶剂也是不同的。有机溶剂影响酶催化的途径有三种:一是有机溶剂与酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;二是有机溶剂和能扩散的底物或产物相互作用，影响正常酶催化反应的进行;三是有机溶剂还可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般认为在非水介质中添加亲水性或和水互溶性的有机溶剂对反应不利，因为它们会夺取酶周围微环境的必需水，从而使酶失活，所以选择的有机溶剂疏水性越强越好。有机溶剂疏水性的强弱通常是用有机溶剂在水和正辛醇中的分配系数P表示。Laane等人【20j认为，在使用lgP值小于2的有机溶剂时酶的活性较低，而在合成反应(如酷化反应)中，所选的lgP值大于4时被认为是有利的。一般所选择的有机溶剂为饱和烷烃和芳香烃，如苯、甲苯、己烷和异辛烷等。但是事实也并非完全如此一些研究表明，当以各种有机溶剂在水相的浓度相等为基础相比较时，将呈现上述顺序相反的趋势，即极性越小(lgP高)的有机溶剂对酶活有害。在这些场合中，用于比较的化合物都有较高的lgP。因为随着极性的减小，有机溶剂在水中溶解度的降低比其使酶失活能力的降低幅度更大，因而此时高地P的有机溶剂对酶的活性具有稍强的抑制能力。1)对酶的结构与功能2）对酶的活性有机溶剂对酶活性中心的影响:溶剂通过减少酶活性中心的数量对酶的活性产生影响。因为溶剂破坏了酶蛋白活性中心的氢键、离子键或者造成酶蛋白去折叠而导致活性中心的减少。非极性有机溶剂与底物竞争酶的活性中心的结合位点，从而降低了活性中心的极性，减弱了底物与活性中心的结合能力。3）对底物与产物的影响有机介质中酶的反应：底物→进入必需水层→进入酶的活性中心→发生反应产物→分布在必需水层→转移出水层→反应继续有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度有机溶剂极性很小，疏水性太强→疏水性底物在有机溶剂中溶解度大→难于进入必需水层→降低催化速度有机溶剂极性过大→亲水性太强→疏水性底物在有机溶剂中溶解度低→底物浓度降低→催化速度减慢应该选择极性适中的有机溶剂作为介质使用1、底物选择性非水介质中，有机溶剂与底物间的疏水作用比底物与酶间的疏水作用强→疏水性强的底物容易受到有机溶剂的作用→与酶分子的结合受到影响。可见，有机溶剂改变，酶的底物专一性也会发生改变。极性较强的有机溶剂中，疏水性强的底物容易进行反应。极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易进行反应。第九章酶应用的基本理论酶反应动力学定义：研究酶催化反应速度及其影响因素的学科，是酶学研究的重要内容，也是酶应用的重要理论依据。动力学数据处理以及动力学常数的求取（4种方程）Lineweaver-Burk方程：对米氏方程两侧取双倒数Eadie-Hofstee方程：对米氏方程进行改写Hanes方程：对米氏方程进行改写直接线性作图法：将米氏方程改写成常用动力学数据处理方法的比较：Lineweaver-Burk法：最常用的方法，其优点是变量v和[S]在不同的轴上；缺点是在图线上1/v和1/[S]取值范围内存在不均衡的误差分布。Eadie-Hofstee法和Hanes法：其图线中误差分布是均衡的。直接线性作图法：v和[S]值直接表示在图线上，不需要计算就可以得到Vmax和Km值；具有统计合理性，使用Vmax和Km的中位数，减少了v和[S]的极端值对这些参数的影响。米氏方程1913年Michaelis和Menten在前人工作的基础上，根据酶反应的中间复合物学说，推导出底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，称之为米氏方程：★米氏方程及常数的意义1.物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。2.Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。3.Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。4.米氏方程描述了酶催化反应速度与底物浓度之间的关系第十章酶反应器的应用用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器的分类按结构区分为搅拌罐式反应器、填充床式反应器、流化