细生细胞凋亡分化

受精卵分裂、分化组织、器官新个体个体衰老、死亡细胞衰老细胞死亡细胞死亡生物体内每时每刻都有细胞在衰老、死亡：红细胞：寿命120肝细胞：寿命18个月神经元：寿命与机体相当，也存在衰老及异常条件下的死亡细胞为什么会衰老？细胞为什么会死亡？第十六章

细胞衰老与细胞死亡

CellSenescenceandCellDeath第二节细胞死亡一、细胞死亡的概念与形式二、细胞凋亡三、细胞自噬性死亡——II型凋亡细胞死亡的原因（细胞为什么会死？）细胞死亡正常死亡非正常死亡环境因子病理状态物理因素化学因素生物因素一、细胞死亡的概念与形式细胞死亡的概念：是指细胞生命现象的终结。细胞死亡，有两种形式：细胞坏死（necrosis）：在外来致病因子作用下，细胞生命活动被强行终止所致的病理性、被动性的死亡过程。细胞凋亡（apoptosis）：在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。近年来，有学者认为细胞自噬也是细胞死亡的一种方式。细胞坏死与细胞凋亡细胞凋亡（一）细胞凋亡的概念与特征（二）细胞凋亡的影响因素（三）细胞凋亡的分子机制（四）细胞凋亡与疾病（五）细胞凋亡的检测1.细胞凋亡的概念细胞凋亡（apoptosis）：是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。生理性细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD），即在一定时间内，细胞按一定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。细胞凋亡普遍存在于人类及多种动植物中，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中。

（一）细胞凋亡的概念与特征细胞凋亡的事例A.发育中神经细胞的凋亡B.哺乳动物手指和脚趾在发育早期是连在一起的，指（趾）间的蹼通过细胞凋亡被清除，使单个指（趾）分开C.幼体的蝌蚪向成体发育过程中尾部细胞的凋亡2.细胞凋亡的形态学特征主要包括细胞皱缩（cellshrinkage）、染色质凝聚（chromatin

condensation）、凋亡小体（apoptoticbody）形成、细胞骨架解体等，其中以胞核的变化最为显著。（1）细胞核的变化：

核DNA断裂成核小体片段，并向核膜下聚集、浓缩成染色质块，使细胞核呈现新月状、花瓣状等多种形态的核碎片。凋亡细胞核的“新月状”结构(透射电镜）基于荧光染色的光镜下观察基于HE染色的光镜下观察凋亡细胞核的核碎片(透射电镜）（2）细胞质的变化:胞质浓缩线粒体增大，嵴增多，出现空泡化内质网腔膨大细胞骨架结构变得致密和紊乱（3）细胞膜的变化:原有的特化（微绒毛、细胞突起、细胞连接）结构消失细胞膜起泡，但仍保持完整正常情况下位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）翻转到细胞膜的外表面细胞膜的PS染色：Annexin-V抗体（能结合到PS上）（4）凋亡小体的形成有三种方式：发芽脱落机制：凋亡细胞内聚集的染色质块，形成大小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽（budding）、起泡（zeiosis）等方式，形成一个球形的突起，并在根部绞窄脱落，形成一些大小不等，内含胞质、细胞器以及核碎片的膜包小体，即凋亡小体。分隔机制：在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体。自噬体形成机制：凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器和其他胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体，自噬体在与凋亡细胞膜融合后排出胞外，形成凋亡小体。

扫描电镜下的凋亡细胞表面变化A.正常细胞B.微绒毛消失C.凋亡小体（1）DNA片段化细胞凋亡时，内源性核酸内切酶（endonuclease）活化，特异地在相邻核小体的连接区切断DNA链，形成长度为180~200bp整数倍的寡聚核苷酸片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条带（DNA

ladders）。3.细胞凋亡的生化改变凋亡细胞DNA凝胶电泳时呈现梯状条带A。细胞凋亡中DNA内切酶的活化；B。细胞凋亡所形成的180~200bp整倍性DNA片段细胞坏死中：DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”（smear).（2）细胞凋亡中的蛋白酶主要是胱天蛋白酶（cysteineasparticacidspecificprotease，caspase）家族的活化。活化的蛋白酶级联切割（特异性地断开天门冬氨酸残基后的肽键）是凋亡最关键的过程。（3）胞浆Ca2+、pH的变化胞浆Ca2+浓度升高：胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流。内质网释放Ca2+

使其在胞浆中的浓度升高，改变了线粒体膜的通透性，引起凋亡。胞浆的酸碱化改变：胞浆内的pH先是急速升高，之后又缓慢降低，前者与细胞凋亡的启动有关，而后者是细胞凋亡的结果。

（4）线粒体在细胞凋亡中的作用凋亡时，线粒体发生一系列显著的变化：

线粒体渗透转变孔（permeabilitytransitionpores,PTpores）通透性增高——此为凋亡早期的决定性改变。PT孔是线粒体内膜和外膜在接触部位所形成的孔道。呼吸链受损，能量代谢受到破坏。释放细胞色素C（cytochromeC,cytC），cytC是胱天蛋白酶（caspase）的激活物。产生活性氧类物质（reactiveoxygenspecies,ROS）增多。

线粒体内膜和外膜形成转位接触点4.失巢凋亡：是又一种形式的细胞程序死亡失巢凋亡（anoikis）：是又一种形式的细胞程序死亡，是细胞在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡，是因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的。在组织更新快的细胞中表现更为明显。例如，小肠上皮细胞、成纤维细胞等。失巢凋亡的意义：防止脱落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方。肿瘤细胞，尤其是转移的恶性肿瘤细胞，具有极强的抗失巢凋亡特性，从瘤体上脱落进入循环系统后并不发生凋亡，从而完成转移过程。细胞凋亡的性质与细胞坏死完全不同，两者属于截然不同的细胞学现象。5.细胞凋亡与细胞坏死的比较细胞坏死是指细胞受到激烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和死亡。细胞坏死时，细胞膜发生渗漏，细胞内容物（包括膨大、破碎的细胞器以及染色质片段等）释放到胞外，导致炎症反应。细胞凋亡过程中，细胞膜反折并包裹断裂的染色质片段或细胞器等，随后逐渐分离而形成众多的凋亡小体，并最终为邻近的吞噬细胞所吞噬破坏。整个凋亡过程中，细胞膜的完整性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中，因此并不引发炎症反应。细胞凋亡与细胞坏死的形态比较

细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜完整，形成凋亡小体破损细胞核固缩，DNA片段化弥漫性降解染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状线粒体自身吞噬肿胀细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被相邻细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状基因活动由基因调控也有基因调控自吞噬常见缺少蛋白质合成有无（二）细胞凋亡的影响因素

1.细胞凋亡的诱发因素：生理性诱导因子：肿瘤坏死因子及其家族中的Fas配体（FasL）、转化生长因子β（TGF-β）、神经递质、Ca2+、糖皮质激素等。损伤相关因子：热休克、病毒感染、细菌毒素、原癌基因和抑癌基因产物、自由基、缺血、缺氧等。疾病治疗相关因子：化疗、放疗、生物治疗、中药治疗等。某些细胞毒性物质：如乙醇、氧化砷、β-淀粉样肽等。细胞凋亡的发生受两种因素调节：2.细胞凋亡的抑制因素：

生理性抑制因子：如bcl-2原癌基因和突变型p53基因产物、各种生长因子、细胞外基质、中性氨基酸、性激素等。病毒基因：腺病毒基因表达产物E1B等。

其他：线虫的ced-9基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制因子、促癌剂。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2002wasawardedjointlytoSydneyBrenner,H.RobertHorvitzandJohnE.Sulston

"fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath'".SydneyBrennerJohnE.Sulston2002年诺贝尔生理学和医学奖表彰他们发现了在器官发育和

“程序性细胞死亡”过程中的基因调节

H.RobertHorvitz（三）细胞凋亡的分子机制1.细胞凋亡调控基因的发现：早期来源于对线虫体细胞凋亡的研究后来于哺乳动物细胞中找到了其同源物在线虫中发现了调控细胞凋亡的ced基因家族与线虫细胞凋亡的相关基因可大致分为4组：第一组基因：包含ced-3、ced-4和ced-9基因，在线虫的凋亡调控中有重要意义；第二组基因：包含ced-1、ced-2、ced-5～ced-8以及ced-10，与凋亡细胞被吞噬清除过程有关；第三组基因：包含核酸酶基因1（nmc-1），并非凋亡所必需；第四组基因：包括ces-1、ces-2以及egl-1和her-1，是影响特异细胞类型凋亡的基因，与某些神经元和生殖系统体细胞的凋亡有关。线虫：成虫的体细胞总数为1090个，发育过程中有131个体细胞发生凋亡ced-3的哺乳类同源物：胱天蛋白酶（caspase）家族。ced-4的哺乳类同源物：细胞凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosisproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1）。ced-9的哺乳类同源物：ced-9与哺乳动物的bcl-2家族具有一定的同源性。哺乳动物中线虫ced基因的同源物2.细胞凋亡（人和哺乳动物中）的调控基因（1）caspase（胱天蛋白酶）家族基因为一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，它们的共同特点是能特异性地断开天门冬氨酸残基后的肽键。caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10：参与凋亡的起始。caspase-3、caspase-6和caspase-7：参与凋亡的执行，它们能降解多种底物，导致核纤层和细胞骨架的断裂崩解等。凋亡的起始者（如caspase-8）与执行者（如caspase-3）之间存在上下游的关系，即起始者活化执行者。caspase-1、caspase-11：主要参与白细胞介素前体的活化，并不直接参加凋亡的信号转导。Apaf-1（细胞凋亡蛋白酶活化因子-1）：存在于细胞质中，其功能是活化caspase-9，进而激活caspase-3，导致细胞凋亡。bcl-2基因家族(2)bcl-2基因家族：既能抑制又能促进细胞凋亡bcl-2基因是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2,bcl-2)的缩写。有的成员对凋亡起抑制作用，如Bcl-2（也称存活基因，survivalgene

）,定位于细胞的内膜；有的成员是凋亡的促进者，如Bad、Bax等。（3）p53基因：参与调节细胞的凋亡P53是抑癌基因，能引起细胞周期阻滞，诱导凋亡。P53基因产物诱导细胞凋亡可提供一种防御机制，使DNA损伤的细胞不能存活——此为P53基因的主要功能。人类p53蛋白存在两种形式，二者均参与调节细胞凋亡：野生型（wtp53）：就是P53抑癌基因突变型（mtp53）：可灭活野生型的功能，抑制凋亡并导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤行为。（4）

Fas和FasL：可触发细胞凋亡Fas是属于肿瘤坏死因子受体（tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）和神经生长因子受体（nervegrowthfactorreceptor,NGFR）超家族的细胞表面分子。多钟哺乳动物细胞表达Fas。Fas配体(Fasligand,FasL)是TNF家族的细胞表面分子，仅表达于活化的T细胞。FasL与其受体Fas结合将导致携带Fas的细胞凋亡。Fas/FasL的重要生理作用表现在：Fas/FasL触发细胞凋亡。Fas/FasL对免疫系统细胞的死亡起重要作用。Fas/FasL介导免疫“赦免”。（5）c-myc基因：既是凋亡的激活因子又是抑制因素c-myc基因可以产生两种翻译产物c-Myc1和c-Myc2，两者的作用不同，有时甚至是相反的，受作用细胞的微环境、时期、位点以及自身的质和量的影响。

c-myc主要参与转录，既是凋亡的激活子又是凋亡的抑制因素。除了上述基因或蛋白产物，其他一些基因如ice基因、jun基因、c-fos基因及myb基因等都已证明与凋亡有关。2.细胞内外因素主要通过两种信号转导途径调控细胞凋亡目前在哺乳动物中了解比较清楚的凋亡信号途径：一是细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡信号通路；另一是以细胞内部线粒体为核心的细胞凋亡信号通路。（1）死亡受体介导的信号转导通路

细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体(deathreceptor,DR）结合,激活细胞凋亡信号通路,导致细胞凋亡。哺乳动物死亡受体主要成员：Fas/Apo-1/CD95、DR-4/TRAIL-R1、DR3/WSL-1/Apo-3/TRAMP。在Fas/Apo-1/CD95，配体FasL与Fas结合后,诱导Fas胞质区内的死亡结构域（deathdomain,DD）结合Fas结合蛋白(FADD),FADD再以其氨基端的死亡效应结构域结合caspase-8前体,形成Fas-FADD-caspase-8前体死亡诱导复合物(deathinducingsignalingcomplex,DISC),激活caspase-8,活化的caspase-8进一步激活执行死亡功能的效应蛋白caspase-3，6，7等,导致细胞凋亡。（2）线粒体介导的信号转导通路

许多凋亡信号都可以引起线粒体的损伤和膜渗透性改变。bcl-2家族的蛋白如bcl-2、bax、bcl-XL等都定位于线粒体膜上，bcl-2通过阻止cytC从线粒体释放来抑制凋亡；而bax则通过与线粒体上的膜通道结合，促使cytC的释放而促进凋亡。进入胞浆的cytC可以与Apaf-1一起与caspase-9的前体结合，从而导致caspase-9的活化，后者可以激活caspase-3，引起细胞凋亡。活化的caspase-8，一方面作用于caspase-3前体，另一方面催化BID（bcl-2家族的促凋亡分子）裂解成两个片段，其中含有BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，引起线粒体内cytC高效释放。

细胞凋亡的信号传导途径具有以下特点：传导途径的启动可因细胞的种类、来源、生长环境及诱因的不同而存在差异；凋亡信号传导系统具有多样性；细胞凋亡的信号途径与细胞增殖、分化的途径存在一些共同通路；凋亡的多条信号途径间存在互通的交叉部分。（四）细胞凋亡与疾病

1.细胞凋亡过低导致相关的疾病发生

肿瘤：凋亡抑制基因和凋亡活化基因表达异常系统性红斑狼疮：Fas表达缺陷，导致T淋巴细胞凋亡障碍2.细胞凋亡过度导致相关的疾病发生

神经退行性疾病AIDS

心血管疾病（五）细胞凋亡的检测：如何确定细胞凋亡1.形态学检测：观察是否有凋亡的细胞形态学改变普通光学显微镜：HE染色、甲基绿－派诺宁染色、Giemsa染色。荧光显微镜：荧光标记（如吖啶橙、Heochst33258染色，能与DNA结合的燃料），看核碎片（DNA断裂片段）。电子显微镜：超薄切片、观察核碎片、细胞内空泡、凋亡小体等。细胞凋亡最显著的生化特征：内源性核酸酶激活后，染色体断裂形成约为180~200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。可用下述方法检测：琼脂糖凝胶电泳法（提取DNA、电泳，观察是否有梯度带）。原位末端标记法（TUNEL染色）：由于凋亡细胞DNA为核酸内切酶切割产生3'-OH末端，因此带有标记的脱氧核糖核苷酸衍生物-dUTP能够掺入到凋亡细胞与dATP形成多聚体（原缺口平移产生）、再与抗末端标记物的抗体孵育，即可检测出。2.生化特征检测TUNEL染色3.流式细胞仪检测

凋亡使细胞在细胞、亚细胞和分子水平发生特征性改变，造成荧光染料（PI,碘化丙啶）对凋亡细胞DNA可染性(DNAstainability)发生改变，致使凋亡的细胞在G1期出现低于二倍体含量的峰（G0/G1期之前的亚二倍体峰），成为细胞凋亡的重要标记之一。三、细胞自噬性死亡——II型细胞凋亡

细胞自噬（autophagy）：是真核生物中普遍存在的过程，通过降解细胞内的长寿命蛋白质和细胞器，产生氨基酸以维持细胞在缺乏营养时的生存。显著特征：形成有双层膜包绕的自噬体（autophagosome）。1.细胞自噬的概念细胞自噬的发生受多种基因的调控：ATG(autophagy-related)基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等。A．细胞自噬过程示意图；B.自噬体（膜）形成细胞自噬的分类

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，细胞自噬可分为3种主要类型：巨自噬(macroautophagy)：巨自噬即通常所指的自噬，自噬过程中，细胞浆中的可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构包裹，即自噬泡，并被自噬泡携带到溶酶体中降解加工。微自噬(micro-autophagy)：微自噬主要是溶酶体的膜直接包裹，如长寿命蛋白并在溶酶体内降解。分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy，CMA)：分子伴侣介导的自噬首先由胞浆中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体结合后，转运到溶酶体腔中,被溶酶体酶降解。

CMA的底物是可溶的蛋白分子，所以，CMA降解途径在清除蛋白质时是有选择性的，而前两者无明显的选择性。2.细胞自噬性死亡：长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为。近年来发现，在某些条件下，过渡的细胞自噬也能导致细胞死亡，被成为”II型细胞凋亡“

小结与学习要点掌握细胞凋亡的概念及形态学和生化特征。掌握细胞凋亡与细胞坏死的区别熟悉细胞凋亡的调控基因和信号转导通路。熟悉细胞衰老的概念、Hayflick界限。了解细胞衰老的学说与机制。了解细胞自噬的概念及意义。第一节细胞衰老一、细胞衰老的概念细胞衰老（cellularaging,cellsenescence：细胞在正常条件下发生的生理功能衰退和增殖能力减弱以及形态发生改变并趋向死亡的现象。细胞衰老是机体的衰老和老年病发病的基础。正常培养的成纤维细胞衰老的细胞1.细胞衰老与机体的衰老既有区别又有联系机体衰老：指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的、不可逆的生物学现象。细胞衰老与机体衰老的区别：机体的衰老与动物的寿命密切相关；个别细胞，甚至机体局部许多细胞的衰老死亡并不影响机体的寿命。机体衰老并不代表所有细胞的衰老。细胞衰老与机体衰老的联系：机体衰老与细胞衰老之间有着密切的联系，机体衰老以细胞总体的衰老为基础。2.机体内各类细胞的寿命不同根据细胞寿命情况将细胞分为三类：细胞寿命接近于动物的整体寿命，如神经元、脂肪细胞、肌细胞等。缓慢更新的细胞，其寿命比机体的寿命短，如肝细胞、胃壁细胞等。快速更新且寿命较短的细胞，如皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等。3.细胞在体外培养条件下的寿命离体细胞同在体细胞一样，也有一定的寿命，其寿命长短取决于培养细胞的平均代数，所取培养组织的年龄、种属等。Hayflick

界限（Hayflicklifespan）：体外培养细胞所具有增殖分裂的极限。细胞的衰老控制着细胞的分裂次数，