农作物种子检验规程 品种质量 品种纯度鉴定 征求意见稿

4农作物种子检验规程品种质量品种纯度鉴定本文件规定了农作物种子品种纯度的鉴定内容、鉴定方法、结果报告等要求。本文件适用于农作物种子。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.1农作物种子检验规程总则GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程播种质量发芽试验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度3.1.1品种variety经过人工选育或者发现并经过改良，形态特征和生物学特性一致，遗传性状相对稳定的植物群体。3.1.2品种纯度varietalpurity种子在形态性状、遗传学特性、生理生化特性等品种特征特性方面的典型一致程度。3.1.3纯度规定值specifiedvalue技术规范或标准中规定的商品种子销售所能容许的品种纯度最低值。3.1.4淘汰值rejectnumbers在考虑种子生产者利益和有较少可能判定失误的基础上，根据样本测定结果，作出有风险接受或淘汰种子批的变异株数。3.2杂株53.2.1自交种(苗、株）inbred-type来自同一个体的雌雄配子的结合或具有相同基因型个体间的交配或来自同一无性繁殖系的个体间的交配形成的种子（植株）。3.2.2异交种(苗、株）outcrosses-type相同母本与非本品种父本杂交产生的种子（植株）。3.2.3异型种(苗、株）off-type一个或多个性状（特征特性）与原品种育成者所描述的性状明显不同的植株。3.3品种纯度鉴定方法3.3.1小区种植鉴定controlplottests选择满足鉴定作物正常生长周期所需基本条件的地块，按照一定布局设置小区并种植种子样品，在性状典型时期通过观察形态特征特性，对品种质量进行鉴定的方法。品种纯度是通过区分同一种子样品种植小区中本品种正常个体与杂株形态特征特性而获得鉴定结果的。3.3.2DNA分子检测方法DNA-basedmethod基于核酸分子水平的检测，通过比较不同样品或不同个体DNA序列表现结果，对品种质量进行鉴定的方法。品种纯度是通过区分同一样品内本品种个体和非本品种个体指纹而获得检测结果的。3.3.3蛋白质电泳检测proteinelectrophoresis基于蛋白质的检测，通过比较不同种子样品个体蛋白质聚集形成的电泳谱带异同或特异性谱带的有无来估测品种纯度的方法。4鉴定内容4.1鉴定目标4.1.1品种纯度鉴定应在品种真实性符合的基础上开展。对于品种真实性无法确定的，也可用该品种中的大多数典型个体代表其品种。4.1.2鉴定品种纯度的关键在于杂株识别、杂株类型和比例的确定。鉴定杂交种品种纯度，鉴定内容包括：a）识别本品种与亲本在形态特征、遗传性状（DNA分子检测）、生理特性（蛋白质电泳）等方面的差异，其中DNA分子检测、蛋白质电泳、可依据亲本互补带的有无识别杂交种与亲本；b)识别杂株的主要类型及比例，自交种个体识别特征为其等位基因具有母本而父本缺失，异交种个体识别特征为其等位基因具有母本而父本错误，异型种个体识别特征为其等位基因具有父本而母本错误或不具有父母本。鉴定常规种品种纯度，鉴定内容主要为依据典型个体的形态特征或谱带的差异，识别分离株、异交种和6异型种个体。4.1.3根据需要，可选择不同的鉴定内容，但应识别对品种产量影响较大的杂株。例如：有时仅鉴定杂交种中的自交个体，也可称为杂交率鉴定。4.2鉴定路径品种纯度的鉴定路径：a)鉴定目标物可为形态特征、遗传性状、生理特性等，采用小区种植、DNA分子检测、蛋白质电泳等不同方法，对种子、生长的幼苗或植株，或其提取的DNA或蛋白质进行鉴定，分析其差异；b)观测单位为一般采用个体（单粒）独立鉴定，结果以种子数目表示。5试样数量5.1送验样品的重量品种纯度鉴定送验样品的最小重量应符合GB/Txxxxx.X《农作物种子检验规程扦样》的规定。根据不同方法和试验精度要求，送验样品重量可作相应调整。5.1依据标准规定值确定试样数量试样数量与该种品种纯度要求的标准值密切相关，品种纯度要求越高则试样数目越大。依据在95%概率下品种纯度标准规定值下至少能测出一粒杂株的原则，确定应鉴定的试样数量，见表1。若测不出杂株，可推断其种子的品种纯度等于或高于所要求的值。例如：品种纯度为98.0%，在95%概率下，理论上要求至少取149粒进行鉴定，若在149粒中未检出杂株可认为该批种子纯度等于或高于96.0%。表1依据品种纯度规定标准确定试样数量(P=95%)在实践中，作为一般通则，若标准允许杂株规定标准值为1/N时，试样数量原则上应大于4N，则其鉴定在统计学上才有意义。对于杂交种，试样原则上应至少含有200粒种子，但基于DNA分子检测法允许使用192粒（适用时可含对照）种子；对于杂交种亲本和常规种种子，试样原则上应至少含有400粒种子，但基于DNA分子检测法，亲本种子允许使用384粒（适用时可含对照常规种允许使用192粒（适用时可含对照）。5.2依据试样数量推算品种纯度为便于检测，也可依据试样大小和95%概率下至少能测出一粒杂株而估测种子样品的品种纯度，见表2。若测不出杂株，就可推断样品中杂株百分率等于或低于各自对应给定的百分率。以品种纯度98.0%为例，表1明确至少鉴定149粒，而表2则明确鉴定160粒测不出一粒杂株，则其杂株百分率等于或小于1.86%，即认为其品种纯度超过98%。表2依据试样数量推测品种纯度（P=95%）76鉴定方法6.1小区种植鉴定小区种植鉴定可在整个生长期选择适宜时期进行，宜在品种特征特性差异最明显的时期（花期或成熟期）鉴定。鉴定的关键在于种子检验员是否具有能正确识别异作物和杂株的能力。小区种植鉴定方法见GB/T3543XXX《农作物种子检验规程品种质量品种真实性鉴定》。品种纯度与品种真实性的小区种植鉴定方法基本相同，主要区别为：a）小区种植株数不同。品种纯度鉴定种植株数根据品种纯度规定要求或约定要求而定，一般来说，若品种纯度规定值或约定值为(N-1)×100%/N，种植株数4N即可获得满意结果，如种子标签标注纯度为98%，即N为50，种植200株即可达到要求。b）小区设计行距不同。品种纯度鉴定采用小区内宽行种植方式，便于观察小区内植株差异。c）鉴定对象不同。品种纯度鉴定要识别出小区内特征特性存在差异的个体，有时还需要鉴别出差异类型，从而确定杂株类型。6.2DNA分子检测不同的品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的DNA序列差异（简单序列重复SSR，单核苷酸变异SNP，核苷酸插入或缺失Indel这种差异或区别可通过从有代表性的试样中提取DNA，筛选能够准确识别品种杂株个体指纹的适宜引物进行扩增，检测其扩增产物，分析不同个体的DNA位点差异，从而区分本品种正常个体与杂株，实现鉴定品种纯度的目的。通过试样预备试验，筛选出能够准确识别该样品杂株的引物，筛选时还需综合考虑引物的杂合度、DNA快速提取和多重组合电泳的潜力。杂交种（自交种、异交种、异型种）或常规种（未纯合、异交、异型）等杂株类型不同，所选引物和数目也有所不同，有时还需借助相应父母本的DNA指纹数据。检测引物数目越多，结果漏检和误判的概率降低，但工作量也随之增加，这需要依据检测目的在可接受结果准确率的前提下进行兼顾。本标准推荐了8～10对品种纯度鉴定引物（见附录A作为优先筛选的候选引物。推荐引物仍未达到筛选效果的，可选择GB/T3543XXX《农作物种子检验规程品种质量品种真实性鉴定》附录A中的引物或其他引物进行纯度鉴定。引物筛选时，可通过小样品试验，确定检测所需引物或引物组合。DNA分子检测方法见GB/T3543XXX《农作物种子检验规程品种质量品种真实性鉴定》。6.3蛋白质电泳方法检测通过电荷效应、分子筛效应和pH梯度等作用，经过一定时间的电泳，使分子大小、电荷多少、pI不同的蛋白质等在凝胶上得到分离，性质相似的蛋白质聚集到一起，在凝胶的不同部位形成一定的谱带。电泳产生的蛋白质带型是由品种的遗传组成决定，通过鉴定杂交种的带型是否具有父本特异的谱带（母本没有的谱带）或者比较个体谱带组成与带型的异同，实现估测品种纯度的目的。蛋白质电泳鉴定杂交种中的异交种或异型种存在一定的局限性。基于蛋白质电泳鉴定，因依据的蛋白质种类和电泳技术不同而有所差异。玉米、大麦、小麦、燕麦、豌豆、向日葵等作物种子蛋白质电泳鉴定品种纯度方法，见附录B。7结果计算和表示87.1以种子数目百分率表示7.1.1百分比结果计算品种纯度以种子数目百分率表示，采用下列公式进行计算：采用小区种植鉴定，计算时采用试样的总数，不计算各重复。对于在检验室鉴定的，可设置鉴定重复。重复之间鉴定结果在容许误差范围之内，则以重复间的平均数表示鉴定结果。若重复间鉴定结果超出容许误差范围（见表3再鉴定第三个重复，与前两个鉴定结果之间的差异比较，计算在容许误差范围之内的平均值作为鉴定结果。表3两个重复间的容许误差（两尾测定，P＝95%)n=40n=60n=80n=400000000007.1.2容许误差使用对鉴定结果需要判定时，以规定值和鉴定试验样品数目查找对应的容许误差（表4）。表4品种纯度的容许误差0000000001923456789如果在表中查不到，可用下式进行计算： T=1.65pq……………式中：T——容许误差；p——品种纯度的规定值；q——100－p；n——试验样品粒数（株数）。7.2以淘汰值方式表示7.2.1依据株数的淘汰值计算淘汰值是表示品种纯度的另一种方式，一般用于品种纯度规定值高的情形。淘汰值的推算采用泊松（Poisson）分布，淘汰值与规定值和样品株数本大小有关，见表5。当样本数目不足时（比如，少于4N需考虑采用淘汰值的风险。表5不同规定标准与不同样本大小的淘汰值（5%概率）%9654 974 6549769如果在表中查不到，可用下式进行计算：R=X+1.65+0.8+1…（A.2）式中：R——淘汰值；X——规定值所换算成的杂株数。7.2.2依据面积的淘汰值计算当计算作物群体数量困难时，淘汰值也可用鉴定一定面积的杂株数表示；当小区行距过窄难以确定小区总株数时，也可用一定播量下杂株数表示。在95%的概率保证下，不同鉴定面积和不同纯度的淘汰值见表6。表6不同鉴定面积和不同纯度的淘汰值（5%概率）252223672234923353346344634573458346945694568结果报告8.1鉴定结果鉴定结果应执行《GB/T3543农作物种子检验规程总则》的检验报告要求，并选择下列方式之一进行结果填报：8.2附加信息附加信息应至少包含以下内容：a)鉴定目标、鉴定目标分析物和鉴定技术方法；b)试验样品描述（例如：净种子、有无其他植物种子等信息试验样品种子数量；c)适用时，所用对照标准物质的来源和描述。（规范性）主要农作物品种纯度鉴定SSR引物信息表B.1玉米推荐SSR引物置bnlg439w1NEDphi96100y1bnlg2291k4VICNEDbnlg240k1phi065k9NEDbnlg249k2VIC表B.2水稻推荐SSR引物7VIC9126NED3NED表B.3小麦推荐SSR引物barc80NEDbarc324NEDbarc164NED注：标记荧光栏所列的仅作为示例，可依据不同（规范性）蛋白电泳鉴定法C.1范围本鉴定规定了采用蛋白电泳鉴定品种纯度的方法程序。本鉴定适用于玉米、大麦、小麦、燕麦、豌豆、向日葵种子。C.3玉米品种醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（AU）鉴定C.3.1仪器设备电泳仪(满足稳压500V)，离心机，垂直板电泳槽，单粒磨，微量进样器，聚丙烯离心管等。C.3.2试剂和溶液配制C.3.2.1化学试剂所需试剂均要求分析纯或以上。包括：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、冰乙酸、甘氨酸、硫酸亚铁、过硫酸铵、尿素、三氯乙酸、考马斯亮蓝R-250。C.3.2.2溶液配制a）凝胶溶液：10g丙稀酰胺，10g尿素，0.2g甲叉双丙烯酰胺（Bis）加蒸馏水溶解，加2mL冰乙酸，0.020g硫酸亚铁，加蒸馏水到100mL。b）催化剂溶液：3.5%过硫酸铵，用前现配。c）样品提取液：12g尿素，12mL冰乙酸加蒸馏水至100mL，加4mLTEMED.d）电极液：1.5%冰乙酸溶液。e）染色液：0.4g考马斯亮蓝加25ml无水乙醇溶解，加50g～60g三氯乙酸，加水至500mL。C.3.3鉴定程序C.3.3.1蛋白提取取200粒种子（精确鉴定时，加大样品数量逐粒磨碎，收入小离心管中，按体积1:1.5加入提取液，摇匀，静置30min，然后在18000×g条件下离心5min～10min，取上清液备用。C.3.3.2凝胶制备将玻璃板装好后固定在夹心式电泳槽上，取10mL左右凝胶溶液加一滴催化剂，摇匀迅速倒入电泳槽底部5min左右聚合（室温下封好底。取约40mL凝胶溶液(A.1.2.2a)，加2滴催化剂溶液(A.1.2.2b)，摇匀，迅速倒入玻璃板之间，迅速插入样品梳，让其在2min～3min内聚合。C.3.3.3电泳分离抽出样品梳，用注射器吸去样品槽中的水分，用微量进样器吸取30μL～40μL样品加入样品槽中。将电泳槽内注入电极液(A.1.2.2d)，浸没样品槽，中间接正极，左右接负极。打开电源逐渐增加到35V左右，电泳80min～90min。C.3.3.4固定染色将胶板取下，置500mL染色液(A.1.2.2e)中染色至谱带清晰，用水冲洗观察。根据蛋白质谱带的带型，鉴别自交粒、杂粒、杂交粒。C.3.4结果鉴定谱带分析主要依据由于遗传基础的差异所造成的蛋白组分的差异区别本品种和杂株。利用AU－PAGE技术分析所得的蛋白质谱带，在杂种F1代表现为双亲共显性，即在父母本中所具有的蛋白质谱带，在F1代种子内出现，没有新的谱带产生。双亲中有差异的蛋白谱带，同时在F1代同时显现，这种谱带称为互补带。根据互补带的有无区分自交粒和杂交种。只要待测样品中没有父本谱带，就不是该父本的杂交种(图C.1)。只具有母本蛋白质带型的种子被判断是自交粒。在互补带存在的条件下，如果同时出现了父母本所没有的谱带，可判为亲本不纯引起的谱带差异。如果互补带的两条有其中之一缺少，则为自交粒。如果整个带型与本品种有较大差异，则为杂粒。对于不同类型的杂交种，可以这样分析和评价：——单交种(图C.2)：一种包括父本带型和母本带型的杂合带型就可以确定为杂交种；——三交种(图C.3)：母本是一个单交种，具有其双亲的杂合带型。杂交种具有两种带型(父本带型和两条母本带型之一)。然而，经验显示大多数杂交种仅仅表现出一种带型；——双交种(图C.4)：用于杂交生产的父母本都是单交种，因此杂交种子中就会有四种不同的杂合带型。图C.1在父本带出现而在母本带未出现的蛋白带型（箭头所指的阴影带）图C.2单交种的鉴定图C.3三交种的鉴定图C.4双杂交种的鉴定C.4大麦和小麦品种聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定C.4.1仪器设备多数仪器参见C.3.1，采用垂直板电泳槽（如Pharmacia的GE-2/4单粒磨改为钳子。C.4.2试剂和溶液配制C.4.2.1试剂所需试剂需要分析纯或以上级，包括：尿素、乙醇、甘氨酸、派罗宁G（或甲基绿）、三氯乙酸、冰乙酸、过氧化氢（或TEMED）、硫酸亚铁、抗坏血酸、硫代甘油（或α-巯基乙醇）、丙烯酰胺、PAEG蓝G-90（或考马斯亮蓝R-250甲叉双丙烯酰胺、α-氯乙醇。C.4.2.2溶液配制a）提取液：用于小麦的，使用派罗宁G0.05g（或甲基绿）溶于25mLα-氯乙醇中，加蒸馏水至100mL；用于大麦的，使用派罗宁G0.05g（或甲基绿）溶于20mLα-氯乙醇中，加入18g尿素，再加入1mL硫代甘油（或α-巯基乙醇加蒸馏水至100mL。均需低温保存。b）电极缓冲液：0.4g甘氨酸加蒸馏水溶解，加4mL冰乙酸，定容至1000mL。低温保存。c）凝胶缓冲液：1.0g甘氨酸加蒸馏水溶解，加入20mL冰乙酸，定容至1000mL。低温保存。d）0.6%过氧化氢：30%过氧化氢2mL加蒸馏水定容至100mL。低温保存。e）染色液：PAEG蓝G-900.25g（考马斯亮蓝R-250）加25mL无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500mL。f）凝胶液：丙烯酰胺20g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，尿素12g，硫酸亚铁0.01g，抗坏血酸0.2g，用凝胶缓冲液溶解并定容至200mL。低温保存。C.4.3鉴定程序C.4.3.1样品提取取小麦或大麦种子，用钳子逐粒夹碎(夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以便于清理钳头和防止样品间的污染)，置1.5mL离心管中，加入蛋白质提取液（A.4.1.3a）(小麦0.2mL，大麦0.3mL)，充分摇动混合，在室温下静置24h，然后在18000×g条件下离心15min。取其上清液用于电泳。C.4.3.2凝胶制备从冰箱中取出凝胶溶液（A.4.1.3f）和过氧化氢溶液（A.4.1.3d吸取10mL凝胶溶液，加1滴0.6%过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶液，让其在5min—10min聚合封好。吸取45mL凝胶溶液，加3滴0.6%C.4.3.3电泳分离小心抽出样品梳，将玻璃板夹在电泳槽上，用滤纸或注射器吸去样品槽中多余的水分，然后用微量进样器吸取10μL～20μL样品提取液加入样品槽中。注入电极缓冲液（A.4.1.3b浸没样品槽。打开电源，将电压逐渐增加到500V。电泳时，要求在15℃~20℃温度下进行。电泳时间可按派罗宁G迁移时间来推算，宜为派罗宁G移至前沿所需时间的2倍（或甲基绿移至前沿所需时间的3倍）。C.4.3.4固定染色将胶板小心取下，在染色液（A.4.1.3e）中染色1d～2d。一般情况不需要脱色，但为使谱带清晰，可用清水冲洗。C.4.4结果鉴定根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性，并与标准样品电泳图谱相比较鉴定种子纯度，电泳谱带标准样品不一致的记为杂粒。谱带命名可采用相对迁移率法或Konarev，V.B.（1979）的迁移率计算方法，或按照Shewry（1979）带型命名方法。C.5燕麦品种聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定C.5.1仪器设备C.5.2试剂和溶液配制C.5.2.1试剂所需试剂均要求分析纯级或以上等级。试剂包括：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、冰乙酸、甘氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、过氧化氢、派罗宁G（或派罗宁Y）、三氯乙酸、乙二醇、甲醇、考马斯亮蓝R-250。C.5.2.2溶液配制配制下列溶液并低温保存：a）提取液：派罗宁G0.05g（或派罗宁Y）溶于25mL乙二醇中，加入18g尿素，加蒸馏水至100mL。b）电极缓冲液：0.4g甘氨酸加蒸馏水溶解，加4mL冰乙酸，定容至1000mL。c）凝胶缓冲液：1.0g甘氨酸加蒸馏水溶解，加入20mL冰乙酸，定容至1000mL。d）0.6%过氧化氢：30%过氧化氢2mL加蒸馏水定容至100mL。e）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加25mL无水乙醇溶解，倒入500mL10%三氯乙酸溶液中。f）凝胶液:丙烯酰胺25.0g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，尿素12.0g，硫酸亚铁0.01g，抗坏血酸0.2g，用凝胶缓冲液溶解并定容至200mL。C.5.3鉴定程序C.5.3.1蛋白质提取取燕麦种子，除去内外稃，用钳子逐粒夹碎或磨碎，注意防止样品之间的污染。将细粉置于1.5mL离心管中，加入0.1mL提取液（A.5.1.2.2a充分摇动混合，在室温下提取2h或过夜，然后在14000×g条件下离心5min～10min。取其上清液用于电泳。C.5.3.2凝胶制备玻璃板首先硅烷化，然后装好电泳槽。从冰箱中取出凝胶溶液（A.5.1.3f）和过氧化氢溶液（A.5.1.3d吸取10mL凝胶溶液，加1滴0.6%过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶液，让其在5min～10min聚合封好。吸取45mL凝胶溶液，加90μL～100μL0.6%过氧化氢，迅速摇匀，倒入凝胶板之间，马上插好样品梳，让其在5min～10min内聚合。C.5.3.3电泳分离小心抽出样品梳，将玻璃板夹在电泳槽上，用滤纸或注射器吸去样品槽中多余的水分，然后用微量进样器吸取18μL样品加入样品槽中。20℃温度下进行。电泳时间一般为60min～80min，可按派罗宁G迁移时间来推算，宜为派罗宁G移至前沿所需时间的2倍。C.5.3.4固定染色将胶板小心取下，在染色液中染色1～2天。一般情况不需要脱色，但为使谱带清晰，可在清水中漂洗2h~3h。背景色过深可以用10%的TCA溶液（A.5.1.3e）漂洗，然后成像观察。C.5.4结果鉴定根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性，并与标准参照样品电泳图谱相比较，计算种子纯度。C.6豌豆品种聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定C.6.1仪器设备电泳仪(满足稳压500V)，离心机，垂直板电泳槽，单粒粉碎机，微量进样器，聚丙烯离心管等。C.6.2试剂和溶液配制C.6.2.1试剂所有试剂应是分析纯级或以上的等级，包括：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、盐酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙三醇、2-巯基乙醇、二甲基甲酰胺、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甲醇、冰乙酸、三氯乙酸（TCA）、PAGE蓝G-90或考马斯亮蓝R型染料、溴酚蓝。C.6.2.2溶液配制所配制的试剂溶液包括：a）分离胶缓冲液：121.1gTris在约750mL的蒸馏水中溶解，用盐酸溶液（滴加约15mL的1mol/L稀释液）调节pH值至8.8定容至1L，在4℃下保存。b）浓缩胶缓冲液：30.3gTris在约200mL的蒸馏水中溶解，用盐酸溶液（先滴加约8mL浓盐酸，再加1mol/L的溶液）调节pH值至6.8，定容至250mL，在4℃下保存。c）SDS溶液：10gSDS用蒸馏水溶解（轻轻搅拌并加热定容至100mL。若出现SDS结晶析出，可稍加热使其重新溶解。在室温下保存。d）1%过硫酸铵溶液（APS0.1g过硫酸铵溶解在10mL蒸馏水中，该溶液需现用现配。e）样品提取缓冲液储液：取12.5mL浓缩胶缓冲液，加入20mL丙三醇、4gSDS、12mg溴酚蓝和24.1mL的蒸馏水，混匀后在室温下保存。若出现SDS结晶析出，可稍加热使其重新溶解。f）样品提取液：采用样品提取缓冲液储液17份∶3份巯基乙醇∶40份蒸馏水混合。通常只配足一天内的使用量。g）固定液：在400mL的甲醇中加入100mL的冰乙酸，加水定容至1L。配制每块胶大约需要200mL。配制时也可用（15～20）%的TCA（2.3g）代替冰乙酸。h）染色液：先配制15%三氯乙酸（TCA用三氯乙酸375g加水定容至2.5L；再配制1%PAGE蓝G-90或考马斯亮蓝R250：用1gPAGE蓝G-90或考马斯亮蓝R250溶于100mL甲醇中；然后将15%三氯乙酸200mL加1%PAGE蓝G-90或考马斯亮蓝R25010mL用于一块胶板染色。C.6.3鉴定程序C.6.3.1蛋白质提取用单粒粉碎机逐粒粉碎种子，按照粉碎样品40mg/1.0mL提取液（A.3.2.2f）的比例，放入1.5mL的聚乙烯离心管中混匀。室温下放置1h后，在沸水中加热10min（在管盖上留一小缝隙，防止压力升高然后用涡旋仪混匀。冷却后，在18000×g转速下离心5min，取上清液用于电泳。C.6.3.2凝胶制备选用垂直电泳设备，依据设备类型和说明书安装好清洁干燥胶模。凝胶厚度不应超过1.5mm，否则会影响电泳效果。制作分离胶和浓缩胶方法如下：a）分离胶：准备4个板的凝胶溶液(每板规格为180mm×140mm×1.5mm)，使用56.4mL分离胶缓冲液（A.6.1.3a）)，加86.25mL凝胶溶液(19.6g丙烯酰胺、0.26gBis，加蒸馏水溶解至90mL)，抽去气体，然后加入3.75mL1%APS（A.6.1.3d）、1.5mL10%SDS、75μLTEMED。小心混匀，将溶胶慢慢倒入玻璃板的夹层中，也可以用25mL的注射器灌胶，保持胶面高度有3cm～4cm空间用于灌浓缩胶。然后，在溶胶液面用注射器缓缓覆盖1cm厚的蒸馏水或异丙醇，静置聚合溶胶约1h。b）浓缩胶：吸去覆盖在分离胶上覆盖液，用稀释的浓缩胶缓冲液（A.6.1.3b缓冲液按照1:8的比例进行稀释）冲洗胶面，然后用滤纸吸干。制作4个板的浓缩胶，需要10mL浓缩胶缓冲液（A.6.1.3b）、67.2mL凝胶溶液(4.0g丙烯酰胺、0.07gBis，加蒸馏水溶解至67.2mL)，抽去气体，然后依次添加3.0mL1%APS、0.8mL10%SDS、80μLTEMED。将浓缩胶溶液到入玻璃板分离胶上面，并迅速插入梳子，确保梳齿周围不能有气泡。凝胶聚合约1h。若没有抽气条件，使用较高浓度的APS溶液，即使用3.0mL的2%的APS溶液(0.2gAPS溶解于10mL蒸馏水中)较为合适，也可以使用新配制0.008%核黄素溶液来代替APS溶液。溶胶进行聚合反应需要光照，必要时还要使用紫外灯进行照射。适宜用量需要试验的确定，聚合时间为30min～60min。一般来说，每制50mL的浓缩胶约需核黄素溶液7.5mL。C.6.3.3电泳分离应新配制足够的电极缓冲液。电极缓冲液包括3.0gTris、14.1g甘氨酸、1.0gSDS，用蒸馏水溶解定容至1L(微微加热可以加速SDS的溶解)。在浓缩胶上拔出梳子(该胶相当稀软)，使用电极缓冲液冲洗形成的小槽(即样品槽）后，加入适量的电极缓冲液。使用进样器，将样品加入小槽，进样量多少取决于凝胶厚度和小槽大小，大多数情况下加5μL～15μL较为适宜。加入5μL1%的溴酚蓝水溶液（含10%的丙三醇）于小槽中，作为指示剂。该指示剂也可预先混入样品提取缓冲液。胶模原先用粘条密封的，可将下方（即底部）的粘条去掉，使用电极缓冲液填充小槽，注意不应搅动样品液。凝胶置于电泳槽中，每块胶先在25mA电流下电泳，若前沿指示剂迁移出浓缩胶后，将电流增至45mA，直至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部为止。温度应保持在15℃~20℃范围内，电极缓冲液可用自来水或冷却液进行循环冷却。C.6.3.4固定染色若不需要立即得出结果，在电泳结束后从胶模中取出凝胶放入固定溶液（A.6.1.3g缓慢摇动至少1h。再用蒸馏水漂洗5min，然后放置于染色液（A.6.1.3h）中至少2h(通常过夜）。将染色后的凝胶用蒸馏水漂洗2h～3h（如背景颜色较深，可加入TCA然后密封于聚乙烯袋中，供观察或拍照。若密封得当，凝胶可在4℃下能保存数月。若需要快速染色，凝胶可放在较高温度（80℃)下固定和染色30min，然后冷却，再放入10%冰乙酸和35%乙醇溶液中，摇动脱色30min～60min。C.6.4结果鉴定通常比较样品的蛋白质谱带类型是否与标准样品一致。应在每块胶上都配加一个已知样品作为对照，该对照品种应具有确定的蛋白质谱带及其详尽描述。如对照品种的谱带清晰可靠，可作为该胶片的定性标准，对该胶进行分析比较，计数并计算品种纯度。C.7向日葵品种超薄层等电聚焦电泳(UTLIEF)鉴定C.7.1仪器设备带有冷却系统和满足高压电源的水平电泳设备。C.7.2试剂和溶液配制C.7.2.1试剂所有化学药品应达到分析纯或者相近纯度。包括：2-氯乙醇，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(BIS)、两性电解质（AmpholytespH5～8和pH4～12、过硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、尿素、硫代甘油、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸(碱性)、L-赖氨酸、乙二胺、三氯乙酸(TCA)、考马斯亮蓝R-250和G-250、乙醇、冰乙酸，玻璃烷化剂（Repelsilane）。C.7.2.2溶液配制a）样品提取液：30mL2-氯乙醇加水定容至100mL。该溶液可以在室温下保存。b）阳极溶液：0.83gL-天冬氨酸和0.92gL-谷氨酸加热蒸馏水溶解，定容至250mL。该溶液在4℃下能保存2个星期。c）阴极溶液：1.18gL-精氨酸、0.91gL-赖氨酸和30.00mL乙二胺加蒸馏水溶解并定容至250mL。该溶液在4℃能保存2个星期