RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461对银屑病及相关病理性血管新生的药理作用

RNA聚合酶Ⅰ抑制剂CX-5461对银屑病及相关病理性血管新生的药理作用研究背景银屑病是一种常见的慢性免疫炎症性增生性皮肤病,病程长,且易复发。临床表现主要以红斑,鳞屑,瘙痒为主。银屑病的主要组织病理学表现为表皮细胞过度角化,炎细胞浸润以及毛细血管增生。银屑病的病因及发病机制目前尚不完全清楚。但目前认为银屑病的发生不是单一因素的结果,可能涉及多个方面,如遗传背景、感染、免疫异常、内分泌因素、精神紧张等。目前,临床上用于治疗银屑病的药物副作用大,并且无法达到根治的目的。因此寻找新的药物靶点具有十分重要的意义。CX-5461是一种新型的特异性RNA聚合酶Ⅰ(PolⅠ)抑制剂。以往研究证实,CX-5461能够抑制肿瘤细胞增殖,对某些白血病和实体肿瘤表现出较好的治疗效果。我们课题组在前期研究中发现,CX-5461对机械损伤引起的动脉血管内膜增生和再狭窄有显著的抑制作用,对移植后血管新生内膜增生和血管炎症的发展也有抑制作用,并且CX-5461能够有效抑制心肌成纤维细胞的活化及表型转化。CX-5461是否对银屑病病变的发生发展有抑制作用目前尚没有研究。研究目的在本研究中,我们使用成熟的银屑病模型和血管新生模型,探索PolⅠ特异性抑制剂CX-5461对银屑病以及内皮细胞血管新生功能的药理作用。研究方法用咪喹莫特乳膏处理C57BL/6小鼠皮肤建立银屑病模型。CX-5461溶于DMSO中,局部皮肤涂抹给药。将小鼠随机分成4组:正常对照组(sham)、造模+DMSO组(溶剂对照)、造模+CX-5461低剂量组(2μM)、造模+CX-5461高剂量组(5μM)。局部涂抹治疗1周后,取材进行组织病理学和分子生物学检测。HE染色观察角质层厚度变化。免疫组织化学染色观察炎症细胞CD68阳性细胞数量。Lectin和CD31染色观察血管新生情况。用实时定量PCR方法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-17、IL-23、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1[β的表达。体外培养人角质形成细胞(Hacat),用流式细胞术检测细胞周期。用皮下种植海绵垫以及腹部皮下注射Matrigel方法建立血管新生模型。将种植海绵垫的C57BL/6小鼠随机分成4组:生理盐水对照组、血管内皮生长因子(VEGF)刺激组、CX-5461组、CX-5461+VEGF组。将腹部皮下注射Matrigel的C57BL/6小鼠随机分成3组:Matrigel组、CX-5461低剂量组(2μM)组、CX-5461高剂量组(55μM)。2周后取材进行组织学检测。免疫组织化学及Lectin染色观察新生血管数量的变化。体外培养人毛细血管内皮细胞,用CCK-8法检测细胞增殖能力,用划痕实验检测细胞迁移能力,用小管成型实验检测细胞的成管能力,用流式细胞术检测CX-5461对细胞周期的影响。用Westernbolt检测内皮细胞中p53及磷酸化p53的蛋白水平。研究结果在银屑病模型中,CX-5461明显改善了银屑病的皮肤症状(病变皮肤表面鳞屑减少,皮肤皱褶减少,红肿明显减轻)。HE染色结果显示,与溶剂对照组相比,CX-5461治疗明显抑制了角质细胞的增生。免疫组织化学染色发现,CX-5461治疗组病变部位的新生血管数量与溶剂对照组相比明显减少。另外我们发现CX-5461能够减轻病变部位的炎症反应。免疫组织化学检测结果显示,与对照组相比,CX-5461治疗组CD68+细胞数明显减少。实时定量PCR结果显示CX-5461治疗组TNF-α、IL-17、IL-23、IL-lβ的表达水平下降,而IL-6、IL-8、IL-10的表达升高。在皮下种植PVA海绵垫血管新生模型中,CD31染色及Lectin化学染色显示,VEGF组与对照组相比血管数量明显增加;CX-5461治疗显著减少了基础水平和VEGF刺激后的血管新生过程。在Matrigel胶血管新生模型中,CD31免疫化学染色显示,CX-5461治疗显著减少了血管新生数量。体外培养的细胞中,CX-5461对血管内皮细胞的增殖有剂量依赖性的抑制作用。同时,CX-5461能明显抑制血管内皮细胞的迁移能力和成管能力。并且,CX-5461对角质形成细胞和内皮细胞的细胞周期有抑制作用,可以将细胞阻滞在G2/M期。在血管内皮细胞中,CX-5461对p53蛋白总量的作用不明显,但能显著增加p53磷酸化水平。用p53抑制剂PFT-α预处理能够减轻CX-5461对内皮细胞迁移的抑制作用,而对内皮细胞成管能力的作用不明显。结论局部应用CX-5461