SN 1199-2003棉花中转基因成分定性PCR检 测 方 法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准棉花中转基因成分定性PCR2003-03-17发布国家质量监督检验检疫总局I本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1本标准规定了抗鳞翅目昆虫棉花中转基因成分的定性PCR检测方法。聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)3.3.4dATP:deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸。3.3.5dCTP:deoxycytidine3.3.7dTTP:deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸。23.3.10EDTA.ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺3.3.12Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷。3.3.14CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花叶病毒35S启动子。3.3.17CryIA(b)-CryIA(c):asyntheticgeneencodes608aminoacids,productidenticaltothatofcryIA(b)geneandcryIA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,Kursta3.3.18CrylA(c):asyntheticgeneencodesinsecticidal-activetruncatedproductidenticaltothatofcrylA(c)geneofBacillusthuringiensissubsp,KurstakisteainHD-73苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白4防污染措施5抽样和制样6测定方法6.1原理浓度为5pmol/L。其中外源基因的有关信息参见附录A。被检测基因基因来源引物序列扩增片段长度/bp退火温度/℃内源5'-tct-gcc-cta-tca-act-tte-gat-ggt-a-3'5¹-aat-ttg-cgc-gcc-tgc-tgc-ctt-cct-t-3外源5-get-cct-aca-aat-gcc-atc-a-3'5'-gat-agt-ggg-att-gtg-cgt-ca-3'3表1(续)被检测基因基因来源引物序列扩增片段长度/bp退火温度/℃外源外源外源外源外源6.2.21mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),溶于800mL水6.2.30.5mol/LEDTA(pH8.0):在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠6.2.5CTAB沉淀液：称取5.0gCTAB,2.3376g氯化钠，加水溶解定容至1L,分装后高压灭菌6.2.11·70%乙醇。6.2.12TE缓冲液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加水定容至1L,分装后高压灭菌备用。6.2.1310×PCR缓冲液：含500mmol/L氯化钾(KCl),100mmol/LTris-HCl(p氯化镁(MgCl₂),0.1%明胶。6.2.2150×TAE缓冲液：称取484gTris,量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA6.4.1.2加入1.3mLDNA抽提缓冲液，涡旋震荡30s后，颠倒混合5min(注意不要使样品结块),6.4.1.3室温10000g离心10min,取上层溶液800μL,加入5μLRNaseA(10μ6.4.1.4加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1),颠倒混匀1min。6.4.1.5室温10000g离心10min,取上清液600μL,加入2倍体积的CTAB6.4.1.6室温8000g离心10min,弃上清液。6.4.1.7加入800μL氯化钠(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室温放置5min,加入等体6.4.1.8室温10000g离心10min,取上清液600μL,移入1.5mL的Eppendorf管中，加入0.6倍体6.5提取物纯度和浓度测定样品DNA用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm5 (2)为空白对照。检测转基因棉花中内外源基因采用的PCR反应体系见表2。每个反应体系应设置两个次序50pL反应体系加样体积/pL加样体积/μL110×PCR缓冲液210×dNTPs(各2.5mmol/L,含dUTP)310X氯化镁(25mmol/L)4Tag酶(5U/μL)5正义引物(5pmol/L)6反义引物(5μmol/L)7DNA模板(0.1μg/μL～1.0μg/μL)8加水至注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。表3检测转基因棉花内外源基因的PCR反应循环参数被扩增的内外源基因变性扩增条件循环次数最终延伸CryIA(b)-CryIA(c)注：PCR反应循环参数可根据不同的基因扩增仪进行适当调整。6.6.3PCR扩增产物的电泳检测分析用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备2%琼脂糖凝胶(55℃~60℃时加入左右加入溴化乙锭至终浓度为0.5μg/mL,也可在电泳后进行染色)。取9μLPCR扩增产物，加1μL10×上样缓冲液上样。电泳时，PCR扩增产物按上述上样量上样，并在每行胶孔中选一个胶孔，在其中加DNA分子量标记物混合液以判断PCR扩增产物片段的大小。电压大小一般控制在3V/cm～5V/cm,电泳时间根据PCR扩增片段长度及溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。6用针对真核生物内源基因18SrDNA基因设计的引物对棉花DNA提取液进行PCR测试，阴性对照、阳性对照和待测样品都应被扩增出137bp的PCR产物。如未见有PCR扩增产物，则说明DNA提取液质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA,直到扩增出137bp7.2结果判定对棉花样品DNA提取液进行外源基因的PCR测试，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小见表1),则可初步判定待测样品中含有可疑的该外源基因，应进一步进行确证试验，依据确证试验的结果最终报告；如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则可判断待测样品中不含有该外源基因。使检测结果出现假阳性。转基因检测应检测目的基因以排除假阳性的可能。确证试验方法按照SN/T1204中规定的方法执行。8结果表述8.1未检出××××基因。(资料性附录)转基因棉花转入的外源基因的有关信息表A.1