SN 1207-2003猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程_第1页
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程2003-03-17发布2003-09-01实施国家质量监督检验检疫总局I本标准是根据《中华人民共和国进出境动物检疫规程手册》(1997)中方法，并结合猪痢疾诊断方法的研究基础及实践经验编写制定。本标准的附录A是规范性附录。1猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程1范围本标准规定了猪痢疾短螺旋体分离培养的方法。本标准适用于实验室对猪痢疾的诊断。2缩略语下列缩略语适用于本标准。2.2B.h:猪痢疾短螺旋体。2.3B.i:非致病性短螺旋体。2.4B.p:结肠菌毛样短螺旋体。3猪痢疾短螺旋体分离培养3.1材料准备纤牛血等。3.2病料的采取和保存采取新鲜粪便、肠内容物或病变粘膜，不要冰冻，迅速镜检或分离培养。粪便等拭子可置于含有0.5mL磷酸缓冲盐水(0.01mol/L,pH7.2)(见第A.4章)的试管内，密封后0℃~4℃保存，3d内必须分离培养。两头结扎的结肠段，0℃~4℃可保存5d～7d。3.3分离用培养基猪痢疾短螺旋体(B.h)选择分离培养基BJ,其成分和配制方法见附录A,培养基现用现配。3.4操作方法将病料作直接划线或用无荫缓冲液(0.01mol/L.PBS,pH7.2)1:10稀释后接种于BJ培养基，置厌氧培养器内42℃培养，隔3d～5d检查，无菌生长判为阴性。如有B.h生长可见到β溶血区，溶血区呈条状或一端稍尖的椭圆形斑点，此与其他细菌在菌落周围形成圆形溶血区有明显不同。经镜检有BJ培养基37℃培养分离纯培养。在厌氧培养器与抽气机之间，连接负压表、二氧化碳袋和氢气袋各一只，先将容器内空气抽除，然后按负压表上的刻度放进20%二氧化碳和80%氢气。容器内应预先放入适量冷钯触媒(105催化剂),用过的冷钯经160℃烤2h后可反复使用。区分，最终确定应作生化鉴定和致病性测定。4生化鉴定三种细菌的生化区别见表1。2实验猪痢疾短螺旋体结肠菌毛样短螺旋体非致病性短螺旋体溶血吲哚马尿酸盐水解α-半乳糖苷酶活性-葡萄糖苷酶阳性活性β-葡萄糖苷酶活性强十一一十十弱一一—十弱一一—弱—十+一+致病性测定需用10代以内的菌种。将在血液琼脂平皿上的菌落用生理盐水冲洗，低速离心去琼5mL菌液(即5mL×5.0×10'个菌体),另设一肠段注射5mL生理盐水作为对照。另一头接种相同(规范性附录)BJ培养基及试剂的配制A.1基础培养基植物蛋白胨(Phytone)氯化钠琼脂蒸馏水A.2BJ培养基脱纤牛血或马血壮观霉素抗敌素利福平蒸馏水25mg/LA.3抗生素选用及工作浓度参考表置4℃冰箱保存。抗生素贮存液可按每1000mL培养基加1mL的比例制备。抗生素贮存液置4℃冰A.4PBS(0.01mol/L,pH7.2)缓冲液的配制磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.14g去离子水加至1000mL

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