非洲爪蟾在发育生物学中的研究进展

非洲爪蟾在发育生物学中的研究进展摘要：非洲爪蟾是一种有价值的非哺乳动物模型生物，它作为一类两栖纲脊椎动物，利用其作为模式动物具有取卵方便，卵子和胚胎个体大，便于进行等诸多优点，以及其体外受精，体外发育以及胚后发育为变态发育[1]过程，而具有易在实验室人工饲养，以及对研究细胞凋亡，激素调控中是一个很好的材料，因而在发育生物学方面发挥着非常重大的作用。在这篇综述中，主要以研究脊椎动物心脏发育和探索人类先天性心脏缺陷（CHDs）的潜在分子机制和神经系统先天或后天的病变将影响生物体的正常生命活动这两点进行阐述，再提及其他方面的相关研究。关键词：非洲爪蟾发育生物学神经系统心脏疾病研究模式生物一、非洲爪蟾非洲爪蟾又名光滑爪蟾，是南非的一种水生青蛙，是一种重要的模式生物。它们可以长达12厘米，头部及身体扁平，没有外耳或舌头[2]。其后脚上有3趾短爪，是用来挖泥来躲避掠食者。由于没有舌头只能利用其前肢搅食水中的脊椎动物。自然条件下非洲爪蟾以小鱼、虾、蟹、昆虫为食，进食时常迫不及待地用前肢的三只长爪将食物拨进口中。它们完全水栖，无论是蝌蚪还是成蛙，一生都生活在水里，广栖于淡水水域中，尤其喜好静止水域的环境。白天多潜藏于水底深处，夜晚则会爬至浅滩。初春至晚夏间为繁殖期[3]。原产地是非洲东南部，由南非的热带草原起，北至肯尼亚，乌干达西至喀麦隆。二、爪蟾作为模式生物的一些特点从20世纪50年代以来，非洲爪蟾已经成为胚胎学、发育生物学、细胞生物学、功能基因组学等研究的重要模式生物。爪蟾作为模式生物，适合建立多种人类疾病模型进行疾病发病机制和治疗等相关研究，还可以结合生物信息学分析进行高通量药物筛选及药物开发等研究。另外在发育生物学和基因功能研究方面也发挥重要作用。爪蟾作为脊椎模式动物用来科学研究，与其它模式动物有着很多的优势。非洲爪蟾是发育生物学的重要模式生物。它们约需1-2年的时间才达至性成熟，且是有四套染色体的。它们的胚胎很大及容易处理，故在发育生物学上的地位举足轻重。1.爪蟾成为重要的模式生物主要有如下优点：（1）爪蟾是脊椎动物，比果蝇、线虫等更适合于作为人类疾病的模式生物开展研究；（2）产卵量很大，体外受精，胚胎体外分化很快，整个器官发育过程都可以体外观察；（3）卵较大，适合显微操作和胚层分割移植；（4）利用Morhpolinooligonucleotide（MO）微注射技术[4]可以特异性抑制特定基因的表达；（5）爪蟾生活在水中，成体约长7cm，易于在实验室人工养殖，从而养殖本低；（6）易于进行人工繁育，通过注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）可以一年四季产卵，适合于大量繁殖；（7）许多重要基因与人类之间有同源性，如骨形成蛋白（BMP）这为人类基因功能研究奠定了坚实的基础；（8）爪蟾的卵子较大，直径约为1～2mm，且在体外受精、体外发育，因而无需复杂昂贵的仪器，就可在实验室进行显微操作等各种实验；（9）发育早期通过辐射状完全卵裂产生囊胚。其透明的卵壳可以采用手术或化学方法脱去，从胚胎上切下来的细胞团可以依靠细胞中的卵黄提供营养，在无菌的生理盐水中继续发育；[5]2.非洲爪蟾作为模式生物存在的缺陷：（1）难以进行遗传学研究，主要由于其生命周期过长，从受精发育至成熟具有升值能力的成蛙需要一年时间；（2）非洲爪蟾是异源四倍体，多数基因都存在四个拷贝，很难进行遗传突变试验；二、爪蟾在发育生物学中的研究进展1.神经系统发育研究脊髓是脊椎动物胚胎发生过程中发展的第一个中枢神经系统结构，强调了它对机体的重要性。由于其早期形成，羊膜动物对发育中脊髓是具有挑战性的，通常是侵入性，并且适合于对哺乳动物等系统进行建模的实验方法也是有限的。相比之下，两栖动物和非洲爪蟾提供了模型系统，其中脊髓的形成，脊髓神经元和神经胶质的分化以及脊髓神经元和神经肌肉突触的建立可以很容易对整个生物体的微扰进行研究。基因编辑和显微镜方面的重大进展以及最近完成的非洲爪蟾基因组测序重新启动了这种经典模型物种的使用。[6]脊髓功能的发展依赖于脊髓神经元和神经胶质的分配，然后建立突触连接。我们目前对脊髓神经元功能分化的理解便来自非洲爪蟾的研究。Spitzer和Baccaglini的开创性研究调查了体内和体外发育脊髓神经元的电兴奋性的发展。他们发现在神经管闭合后不久，体内未成熟的感觉脊髓神经元就会引发Ca2+依赖性动作电位。随着成熟的进行，动作电位依赖于Na+和Ca2+，并且逐渐地，动作电位的Na+驱动成分变得更加主导，直到Ca2+依赖性成分在受精后3天消失。在发育中的脊髓神经元中从Ca2+依赖性转变为Na+介导的动作电位取决于离子通道表达。而在发育中的神经元中发现Ca2+依赖性动作电位开辟了一个突出且有影响力的研究领域，神经系统发育过程中Ca2+介导的电活动的作用和机制。非洲爪蟾的蝌蚪尾巴之前的神经管、鸡胚第29对体节之前的神经管和哺乳类胚胎骶骨之前的神经管是通过初级神经胚形成的方式形成的。在中胚层脊索的诱导下，胚胎背侧的外胚层增厚成神经板，神经板以头侧宽于尾侧的形态随脊索的生长而增长，随后，神经板沿其长轴凹陷形成神经沟，神经沟两侧的隆起形成神经褶，两侧的神经褶在神经沟的中段靠拢并愈合，继而向头尾侧延伸，形成封闭的神经管。所以说，神经系统发育机制的研究以及各种调节因子的发现、研究以及研制都将是人类精神史上的一大跨越。利用模式生物爪蟾研究神经发育病理是防止先天及后天智力问题的关键。神经系统自身存在的再修复和发育的潜能为改变人类的被动境地将会做出巨大贡献。模式动物的建立是突破神经病变，如脊髓性肌萎缩、遗传性痉挛性截瘫、肌萎缩性脊髓侧索硬化[7]、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、癫痫等疾病的研究治疗关键，探讨人类神经系统的本质奠定基础。2.先天性心脏病研究上世纪三十年代，爪蟾作为研究内分泌生物学的模式生物，被用于早期怀孕的检测，在爪蟾上开展的工作，揭示了发育生物学背后的分子机制和许多信号[8]通路，如尾牙发育的Notch信号，爪蟾有助于脊椎动物的心脏发育的研究，为揭示人类先天性心脏疾病的分子机制提供了有价值的机制。脊椎动物心脏的发育是一个高度保守，精心策划的过程，涉及细胞规格和分化以及心脏组织的广泛形态发生重塑。早期心脏发生已经分析爪蟾通过命运映射的组合方法，移植实验，基因表达分析，组织切片和整装共焦显微术或免疫组织化学和3D重建[9]。虽然哺乳动物和鸟类具有四腔心脏，由两个心房和两个心室组成，但两栖动物具有三室心脏，单心室，类似于哺乳动物的左心室。因此，非洲爪蟾心脏代表了两腔心脏与鸟类和哺乳动物的四腔心脏之间的进化中间体。心脏发育的异常与许多人类先天性心脏缺陷（CHD）有关。CHDS是新生儿的最常见的疾病具有大约1％的活产率以及引起约10％的死产和自然流产率。患者中例如NKX2.5，GATA或T-BOX基因的突变与CHD相关，例如房间隔缺损，DiGeorge综合征或法洛四联症。与其他模型系统相比，非洲爪蟾的几个不同特征强调其对CHD建模的适用性。例如，由于非洲爪蟾的快速胚胎发育，可以快速分析基因功能。由于胚胎在没有功能循环系统的情况下发育，可以在体内研究心血管缺陷的发作。三腔心脏不是缺点，因为心室类似于哺乳动物左心室，并且允许对左心室发育不全综合征缺陷（HLHS）进行建模[10]。与斑马鱼相比，非洲爪蟾心脏中的隔音心房允许研究房间隔缺损。冠状动脉疾病由全基因组关联研究（GWAS）发表在2007年。此后，GWAS精确定位与心血管疾病（心血管病）相关的遗传因素。此外，患者及其亲属的全外显子组测序已经确定了大量可能导致疾病的突变。通过这些方法衍生的大量候选基因产生分离与相关病理学中的无关突变相关的突变的问题。基于MO介导的基因功能可以快速进行爪蟾基因的大规模筛选，目的是验证因果候选基因[11]。另一个GWAS相关联的转录因子CASZ1是有利于的心血管发育。因此，也可用于心脏的适当的生理功能。Casz1的消耗导致沿着腹侧中线的一部分心脏祖细胞停滞。它们作为心脏祖细胞维持，并且在心管形成之前不能最终分化成心肌细胞。免疫荧光分析显示细胞中Casz1下调重新进入细胞周期并且Casz1的缺失导致心肌细胞内的有丝分裂指数增加。因此，Casz1调节细胞增殖。[12]3.爪蟾作为生物再生研究领域的模式生物，使其研究工作开始聚焦于再生功能涉及的再生集团，信号通路，膜电位变化，细胞凋亡等多个方面。4.通过研究表明，选用TPT对热带爪蟾胚胎进行暴漏，研究TPT对热带爪蟾的致畸效应，并比较TPT致畸的表型的差异，为污染物对两栖类种群的影响提供科学依据。5.由于爪蟾的一些特性,使得爪蟾成为模式生物研究环境内分泌干扰效应的重要生物。全氟辛碘酸是一种性质稳定，具生物富集效应的表面活性剂，首先用21天两栖类变态试验，表明PFOS具甲状腺激素干扰效应，可能由于该化合物直接作用甲状腺组织引起，有运用非洲爪蟾完全变态试验，表明PFOS对爪蟾的变态过程具有小剂量刺激效应，引起甲状腺组织结构引起的损伤，导致睾丸组织雌性化，具甲状腺激素和性激素干扰效应。在运用非洲爪蟾完全变态延长实验，表明PFOS能抑制爪蟾变态，另外再运用非洲爪蟾幼蛙实验，表明PFOS虽不能在显微结构上对爪蟾睾丸发育造成影响，但是能使其超微结构损伤，最后用非洲爪蟾蝌蚪进行环境内分泌干扰物筛选进行初步研究。参考文献：[1]HarlandRM,GilchristMJ.Editorial:TheXenopuslaevisgenome[J].DevBiol.2017,426(2):139-142.[2]SachidanandaR,NagadiA,DassAA,etal.Anhidroticectodermaldysplasiapresentingasatrophicrhinitis[J].LaryngolOtol,2004,118(7):556-557.[3]ShinJJ,HartnickCJ.Otologicmanifestationsofectodermaldysplasia[J].ArchOtolaryngolHeadNeckSurg,2004,130(9):1104-1107.[4]叶中德,吴畏.非洲爪蟾早期胚胎发育的wnt信号.生命科学.2007,19(4):359-363.[5]樊启昶,白书农.发育生物学原理.高等教育出版社.2002:74-80.[6]BorodinskyLN.XenopuslaevisasaModelOrganismfortheStudyofSpinalCordFormation,Development,FunctionandRegeneration[J].FrontNeuralCircuits,2017,11(23):341-345.[7]FeesCP,StithBJ.InseminationorphosphatidicacidinducesanoutwardlyspiralingdiskofelevatedCa2+toproducetheCa2+waveduringXenopuslaevisfertilization[J].DevBiol,2019,11(1):371-374.[8]SaiL,QuB.Analysisoflongnon-codingRNAinvolvedinatrazine-inducedtesticulardegenerationofXenopuslaevis[J].EnvironToxicol,2019.24(1):237-239.[9]SlaterPG,HayrapetianL,LoweryLA.Xenopuslaevisasamodelsystemtostudycytoskeletaldynamicsduringaxonpathfinding[J].Genesis,2017,55(1).[10]Soto-AzatC,Peñafiel-RicaurteA.XenopuslaevisandEmergingAmphibianPathogensinChile[J].Ecohealth,2016,13(4):775-783.[11]SharapovMG,NovoselovVI,RavinVK.Xenopuslaevisperoxiredoxins:Geneexpressionduringdevelopmentandcharact