山茶油脱臭馏出物中角鲨烯分离纯化及对细胞糖代谢作用初探

山茶油脱臭馏出物中角鲨烯分离纯化及对细胞糖代谢作用初探角鲨烯(Squalene)是由6个异戊二烯连接而成的不饱和三萜类化合物,存在于鲨鱼肝脏、植物种籽,以及某些微生物、微藻和人体皮脂中。因具有抗氧化、抗辐射、调控胆固醇代谢、抑制有害微生物生长等功效,被广泛用于化妆品、医药和食品工业等领域的开发中。脱臭馏出物是油脂在精炼过程中的副产物,除富含角鲨烯外,还含有植物甾醇、维生素E及少量的酚类物质。本文以山茶油脱臭馏出物(CamelliaOilDeodorizerDistillate,CODD)为原料,采用皂化法初步分离角鲨烯,气相色谱(GasChromatography,GC)与气相色谱-质谱(GasChromatographyMassSpectrometry,GC-MS)定性、定量检测不皂化物中的角鲨烯。硅胶柱色谱法获得角鲨烯纯化物(SqualenePurification,SP),用于研究体外及对猪油的抗氧化性,并初步探究SP对胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)细胞模型的糖代谢作用。本文研究如下:(1)根据国标方法,分析山茶油脱臭馏出物的相关理化指标,为后续提取分离奠定基础。经检测,溶剂浸出法获得的CODD过氧化值为5.3mmol/kg,皂化值(以KOH计)为193.7mg/g,酸值为78.4mg/g,碘值为85.2g/100g,不皂化物含量为12.5%,水分及挥发物含量为0.5%。脂肪酸主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸组成,溶剂浸出法和压榨法获得的山茶油脱臭馏出物中角鲨烯含量分别为535mg/100g、198mg/100g。精密度检测中,日内精密度检测中加标回收率在98.8%～102.4%之间,RSD值在1.60～7.73之间;日间精密度检测中加标回收率在98.4%～102.6%,RSD值介于4.00～8.99,两者都符合RSD<10%的规定,表明检测方法实际可行。(2)采用皂化法初步分离得到富含角鲨烯的不皂化物,并通过正交实验确定最优条件为碱浓度1.3mol/L,料液比1:6,反应时间60min,反应温度90℃,在此条件下,角鲨烯含量为35.2%,提取率为82.0%。通过薄层色谱法(TLC)初步筛选洗脱剂种类和比例,再采用硅胶柱色谱法二次纯化不皂化物。干法上样,200目-300目硅胶,洗脱剂为正己烷:乙酸乙酯=100:1(v/v),滴速为3mL/min。在此条件下,角鲨烯收率为95%,纯度为90%。(3)采用DPPH·和羟自由基两种体外抗氧化评价体系对SP清除自由基能力进行探究。DPPH·实验中,在低浓度时,随着浓度的升高,SP清除作用也随之升高,60μg/mL时达到最佳值,为24.6%,之后趋于稳定。羟自由基实验中,在低浓度时,SP清除效果也随着浓度的升高而升高,在80μg/mL达到最高清除率,为33.6%。在猪油抗氧化实验中,0.02%的SP对猪油有抗氧化作用(P<0.05),高浓度有一定的促氧化作用(P<0.05),且相较于其他抗氧化剂,SP的抗氧化作用相对较弱,但SP与没食子酸丙酯(PG)复配有增效作用(P<0.05)。(4)采用IR细胞模型,初步探究SP对细胞糖代谢的效果。结果表明,200μmol/L的棕榈酸(PalmiticAcid,PA)能成功诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗,并且细胞活力不会受到损伤(P>0.05)。在此条件下,50μg/mL、1000μg/mL和200μg/mL的SP均能增加细胞对葡萄糖的消耗量(P<0.05),增加糖原合成量(P<0.05),且对细胞活力不产生影响(P>0.05)。各浓度均能增加糖原合成酶(GlycogenSynthase,GCS)的活力,且100μg/mL时表现出最佳的效果,与糖原合成量的结果保持一致;50μg/mL和100μg/mL的SP能够显著降低葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6P)的活力,200μg/mL的浓度有降低但效果不显著。甘油三酯(Gglycerintrilaurate,TG)含量没有显著降低(P>0.05),但在一定程度上可以改善细胞的病变情况;给药组丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量均有所下降,且只有100μg/mL时表现出显著性差异(P<0.05);超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)活性均显著提升(P<0.05),表明SP在细胞内具有一定程度的抗氧化作用。综上所述,经皂化分离法能初步得到CODD中的角鲨烯,再通过硅胶柱二次纯化不皂化物,能有效富集、纯化角鲨烯。相比于超临界CO2萃取、分子蒸馏法以及酶法提取法,操作简便易行,设备投入低,维护少,为实现工业化生产提供了一定的科学指导和理论依据。其次,一定浓度的SP