食管癌中癌睾抗原的表达及MAGE-A3特异性T细胞抗肿瘤作用影响因素的研究

食管癌中癌睾抗原的表达及MAGE-A3特异性T细胞抗肿瘤作用影响因素的研究研究背景及目的:恶性肿瘤的发病率和致死率逐年攀升,已经成为威胁人类生命健康的主要疾病。食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一,具有明显地域差别,中国的发病率与死亡率均居世界第一。在我国,90%的食管癌患者为食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC,食管鳞癌),通常发现较晚,尽管治疗手段不断进步,但是5年生存率仅为10%左右。为了进一步提高食管癌患者的生存期和生活质量,研究影响食管癌患者预后的因素、精准的治疗靶点和开发新的治疗手段迫在眉睫。近年来,免疫治疗在实体瘤中的应用显示了巨大的潜力,并在肿瘤的治疗中取得了一席之地,同时过继性T细胞治疗在肿瘤治疗中的地位也与日俱增,目前以肿瘤相关性抗原作为T细胞治疗的靶点已进入临床试验阶段,如疫苗治疗和基因工程化T细胞治疗。癌睾抗原是一类在肿瘤组织中高表达,仅在部分正常组织(生殖系统,睾丸和胎盘组织)中限制性表达的蛋白,而生殖系统为免疫豁免器官,因此癌睾抗原可以作为肿瘤免疫治疗的理想靶点。癌睾抗原的表达同肿瘤的生长、患者的生存期和疾病的复发相关,在体外实验中下调癌睾抗原的表达能够改变肿瘤细胞的生物学特性,降低其粘附和侵袭转移能力,此外癌睾抗原的表达可以作为多种恶性肿瘤不良预后的指标。在过去的研究中,一些HLA-I类分子限制的癌睾抗原肽段已被鉴定出来。同时抗原特异性T细胞在提高疾病的预后方面发挥着作用,已有报道评估了经NY-ESO-1和MAGE-A3疫苗免疫治疗过的黑色瘤患者体内特异性T细胞的比例,T细胞的频度和功能同患者的预后相关,抗原特异性T细胞能够明显提高患者的缓解率并延长肿瘤患者的生存期。然而癌睾抗原的表达以及其诱发的T细胞免疫反应在食管癌中鲜有报道,此外,抗原特异性T细胞在肿瘤部位的功能往往是受损的。肿瘤微环境中,存在很多影响T细胞发挥抗肿瘤功能的因素,如T细胞本身在活化的过程中会高表达一系列抑制性分子包括程序化死亡受体1(Programmeddeath-1,PD-1)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)等,针对T细胞表面的抑制性分子已经开发了一系列的单克隆抗体,尤其是靶向免疫检查点PD-1/CTLA-4的治疗在多种恶性肿瘤中显示了惊人的疗效,但肿瘤微环境中仍存在一些影响T细胞发挥抗肿瘤功能的因素,如肿瘤微环境中的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)能够诱导T细胞的凋亡并能抑制T细胞功能的发挥,并有文献证实肿瘤微环境中的免疫抑制细胞通过产生活性氧而抑制T细胞的活化和功能,而应用活性氧清除剂谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1的阻断是否能够协同抑制T细胞的凋亡和促进T细胞功能的恢复尚无报道。本研究旨在检测癌睾抗原在食管癌肿瘤组织中的表达并分析其同临床参数之间的相关性,发现MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌肿瘤组织中高表达,并同不良预后相关。进一步检测了MAGE-A3特异性CD8+T细胞在食管癌患者外周血中的比例和功能,并分析其比例和功能同食管癌临床参数之间的相关性,证实了PD-1在低反应性CD8+T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞表面高表达,PD-1+CD8+T细胞功能受损,阻断PD-1/PD-L1通路能够在一定程度上增加MAGE-A3特异性T细胞的增殖能力和杀伤功能。肿瘤微环境中能够产生大量的活性氧,PD-1+CD8+T细胞活性氧的表达水平升高,进一步探讨了活性氧清除剂谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1阻断协同增强T细胞的抗肿瘤效果。第一部分癌睾抗原在食管癌肿瘤组织中的表达及其临床意义方法1)RT-PCR检测MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2和NY-ESO-1在食管癌肿瘤组织中的表达。2)分析癌睾抗原基因的表达同临床参数之间的相关性。3)免疫组化分析MAGE-A3和MAGE-C2在食管癌组织中的表达并探讨同预后之间的联系。4)体外实验探讨MAGE-A3/MAGE-C2对肿瘤细胞系生物学特性的影响。结果1)癌睾抗原在正常组织中不表达,在食管癌肿瘤组织中高表达,并具有较高的阳性率。2)MAGE-A3和MAGE-C2的表达同淋巴结转移、肿瘤分期相关。3)MAGE-A3阳性患者的生存期较MAGE-A3阴性患者生存期差,并能够作为一个独立的预后指标。4)MAGE-A3和MAGE-C2同肿瘤细胞株的上皮间质转化相关,下调MAGE-A3/C2的表达能够降低肿瘤细胞株的成球能力和侵袭转移能力,并诱导间质向上皮转化。小结癌睾抗原在食管癌组织中具有较高的阳性率,MAGE-A3的表达可作为一个独立的预后指标,通过改变肿瘤细胞的上皮间质转化影响肿瘤细胞的成球能力和侵袭转移能力,并可以作为免疫治疗潜在的靶点。第二部分MAGE-A3抗原特异性T细胞的比例和功能在食管癌患者中的临床意义方法1)选择HLA-A2和MAGE-A3共阳性的患者,体外培养MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞,用MAGE-A3-Tetramer(KVAELVHFL)标记肿瘤抗原特异性T细胞。2)IFN-g-ELSPOT和PI-AnnexinV双染法分别检测了Tetramer+/CD8+T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。3)流式检测Tetramer+/CD8+T细胞的比例,分析MAGE-A3抗原特异性T细胞的比例和功能同临床资料之间的相关性。结果1)MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T细胞在外周血中比例很低(<0.01%),经负载肽段的DC刺激14d后,Tetramer+/CD8+T细胞的比例均高于0.2%以上。Tetramer+/CD8+T细胞能够对HLA-A2+/MAGE-A3+食管癌细胞株产生特异性杀伤(MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞在体外具有杀伤肿瘤细胞的功能,并能够分泌CD107a和IFN-g)。2)Tetramer+/CD8+T细胞的比例与年龄呈正相关,而与淋巴结转移和肿瘤分期呈负相关(P<0.05)。CD107a的表达水平与临床预后不良的参数呈负相关(如:淋巴结转移、肿瘤分期和肿瘤体积)(P<0.05)。3)功能性Tetramer+/CD8+T细的比例能够提示患者的预后。小结MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T细胞具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能,Tetramer+/CD8+T细胞的功能可作为预测食管癌预后的指标,有功能的MAGE-A3-Tetramer+/CD8+T细胞的比例与患者的生存期呈正相关。本研究为靶向MAGE-A3抗原的疫苗治疗和TCR基因修饰T细胞治疗提供理论依据。第三部分PD-1在食管癌患者无反应性T细胞表面高表达方法1)流式检测MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞上PD-1的表达。2)分选CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞,Real-timePCR检测CD107a+/IFN-g+和CD107a-/IFN-g-的MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞PD-1的表达差异。3)流式细胞仪检测外周血、肿瘤组织和配对正常组织浸润淋巴细胞表面PD-1的表达,并比较了肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1+CD8+T细胞和PD-1-CD8+T细胞功能的差异;对比了肿瘤组织和配对正常组织中抗原递呈细胞和上皮源性细胞表面PD-L1的表达。4)检测了阻断PD-1/PD-L1对MAGE-A3特异性CD8+T细胞增殖能力和功能的影响。结果1)PD-1在无反应性MAGE-A3特异性CD8+T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞表面高表达。2)PD-L1在肿瘤组织中高表达,肿瘤浸润淋巴细胞中的PD-1+CD8+T细胞功能受限。3)阻断PD-1/PD-L1能够在一定程度上增加MAGE-A3特异性CD8+T细胞的增殖和分泌内因子的功能。小结食管癌患者肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞表面高表达PD-1,且PD-1+CD8+T细胞功能受限。通过阻断PD-1/PD-L1能够一定程度上增加MAGE-A3特异性CD8+T细胞的增殖能力和功能。第四部分谷胱甘肽联合阻断PD-1/PD-L1通路协同增强MAGE-A3抗原特异性CD8+T细胞的抗肿瘤效果方法1)检测PD-1+/PD-1-CD8+T细胞凋亡的差异和活性氧表达的差异。2)检测活性氧清除剂谷胱甘肽对T细胞的ROS水平、凋亡和功能的影响。3)体外检测谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1阻断对CD8+T细胞功能的影响。4)动物实验检测在T细胞回输的基础上联合应用谷胱甘肽和PD-1/PD-L1阻断对食管癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。5)分离荷瘤小鼠肿瘤组织中的浸润淋巴细胞,通过流式细胞术检测T细胞治疗组CD8+在肿瘤部位浸润的数目和分泌内因子的功能。结果1)PD-1+CD8+T细胞较PD-1-CD8+T细胞的ROS水平较高,且凋亡细胞比例明显高于PD-1-CD8+T细胞。2)谷胱甘肽能够清除CD8+T细胞的ROS,减少PD-1+CD8+T细胞的凋亡。3)谷胱甘肽联合阻断PD-1/PD-L1协同增强CD8+T细胞增殖能力和分泌内因子的功能。4)在体内试验中,谷胱甘肽能够协同增加阻断PD-1/PD-L1对CD8+T细胞的抗肿瘤的功能,延缓肿瘤的生长。5)谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1阻断能够增加肿瘤部位浸润性CD8+T细胞的绝对数,同时增强其分泌内因子的能力。小结PD-1+CD8+T细胞具有较高水平的ROS和凋亡比例。谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1阻断协同减少ROS水平和细胞凋亡比例,增强CD8+T细胞增殖能力和分泌内因子的功能。谷胱甘肽联合PD-1/PD-L1阻断产生协同的抗肿瘤作用。结论1)癌睾抗原MAGE-A3在食管癌肿瘤组织中具有较高的阳性率,MAGE-A3的表达并可以作为一个独立评价食管癌预后的指标。2)MAGE-A3特异性CD8+T细胞能够特异性杀伤HLA-A2+/MA