液体深层发酵羊肚菌胞内多糖提取、结构分析及抗结肠癌作用研究

液体深层发酵羊肚菌胞内多糖提取、结构分析及抗结肠癌作用研究羊肚菌(MorchellaesculentaL.)是世界公认的珍稀食用菌,营养价值高,保健效果显著,含有多种活性物质,如多糖、蛋白质、矿物质、微量元素、膳食纤维、维生素等,具有降血脂、抗疲劳、抗病毒、消炎、抗肿瘤等诸多功效。羊肚菌一直处于野生状态,人工栽培技术尚不完善,产量不稳定,导致价格偏高,限制了活性物质的开发,尤其是羊肚菌多糖的研究还限于初级层面,没有开展深入的功效机理及分子结构研究。本论文以液体深层发酵羊肚菌菌丝体为研究对象,首次使用高压脉冲电场技术在室温下提取菌丝体胞内多糖,过程中无升温,保证多糖分子结构的完整性;使用多种除杂、纯化技术得到两种中性羊肚菌多糖和两种酸性羊肚菌多糖,鉴于多糖产量和分子量大小的原因,选择产量高的中性多糖进行抗结肠癌活性研究;通过检测相关凋亡基因和蛋白的表达,发现MEPN-B-Ⅱ通过两条路径激活caspase-3,诱导HT-29细胞发生凋亡,控制结肠癌细胞增殖。论文详细分析了MEPN-B-Ⅱ分子结构,获得了单糖组成和糖苷键信息,并首次观察到具有抗结肠癌活性的羊肚菌多糖分子是以一种微球型的微观形态存在,多个分子聚集在一起呈无定型多晶体状态。本论文为深入研究液体深层发酵羊肚菌多糖生物活性和空间结构打下理论基础,主要研究内容和结论如下:(1)本论文分别用超声波-波微协同法和高压脉冲电场法两种技术提取羊肚菌胞内多糖。通过单因素试验和响应面分析法优化两种方法的提取工艺条件。超声波-微波协同法提取多糖的最佳工艺条件为:超声功率250W,微波功率220W,提取时间7min,多糖产量为4.425%。高压脉冲电场法提取多糖的最佳工艺条件为:电场强度18kV/cm,脉冲数7,料液比1:27g/mL,多糖产量为5.693%,比超声波-微波协同法产量提高了28.66%。通过扫描电镜观察两种方法提取后的细胞结构,发现高压脉冲电场法提取后细胞壁破碎彻底,内含物溶出充分,而且整个过程在常温下进行,羊肚菌多糖分子无热降解,提取效率高,耗时短。本试验证实高压脉冲电场适合提取羊肚菌胞内活性多糖。(2)提取液中多糖使用乙醇沉淀,试验发现80%乙醇沉淀效果最好,多糖得率为13.76%;通过比对,筛选出Sevag法除多糖中蛋白质,对多糖分子结构破坏小,多糖得率为70.83?1.79%,脱蛋白率69.29?2.56%;选择AB-8大孔吸附树脂法除色素。间羟联苯法测定羊肚菌多糖中糖醛酸的含量为8.2±0.34%。将除杂后的羊肚菌多糖用DEAE-cellulose离子交换树脂分级纯化,得到羊肚菌中性多糖和酸性多糖;用SephadexG-100葡聚糖凝胶层析柱进一步分离两种多糖,得到中性多糖MEPN-A(得率56.3%)、MEPN-B(得率32.5%)和酸性多糖MEPS-A(得率19.15%)、MEPS-B(得率8.82%)。鉴于酸性多糖产量较低,不利于大量制备,后续试验研究羊肚菌中性多糖。经GPC分析,MEPN-A的分子量超过百万,不利于透过细胞膜。选择MEPN-B作为研究对象,经色谱分析,MEPN-B由MEPN-B-Ⅰ和MEPN-B-Ⅱ组成,分子量分别为222,344Da、81,835Da,多糖含量分别为73.56%和92.12%。(3)通过肿瘤细胞增殖抑制试验,比较了MEPN-B-Ⅰ和MEPN-B-Ⅱ体外对HT-29的抗增殖作用,发现MEPN-B-Ⅱ具有较高抗结肠癌细胞HT-29增殖作用,其抑制作用与多糖呈量效和时效关系。AnnexinV-FITC/PI双染色检测结果显示,800μg/mLMEPN-B-Ⅱ可使22.7%HT-29细胞发生凋亡。RT-PCR荧光定量技术分析多糖作用HT-29细胞后,其Bax基因的表达量显著提高了1.07倍,Bid表达量提高了0.96倍,而Bcl-2表达量则下降0.36倍,导致Bax/Bcl-2比值上升。推断MEPN-B-Ⅱ诱导癌细胞凋亡的路径可能是先通过死亡受体途径激活caspase-8,从而顺式激活下游caspase-3诱导细胞凋亡;而活化了的caspase-8开始切割Bid,转入线粒体通路,通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达,改变线粒体膜电位,增加膜通透性,促进Cyto-C释放,激活caspase-9,活化caspase-3,诱导细胞发生凋亡。检查MEPN-B-Ⅱ对普通人纤维原细胞增殖的影响作用,发现细胞没有出现死亡现象,证明MEPN-B-Ⅱ对正常人体细胞无抗增殖和毒性作用。(4)通过乙酰化和GC分析,MEPN-B-Ⅱ主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔比为10.6:13.1:3.2:29.8:43.3。紫外光谱扫描结果显示,多糖中无蛋白质。甲基化、红外光谱、NMR分析结果表明:MEPN-B-Ⅱ主要是由→4)Glc(1→,→4)Gal(1→,Glc(1→,→4,6)Gal(1→,→2)Man(1→,→4)Xyl(1→和→2,4)Rha(1→组成。MEPN-B-Ⅱ主链的主要单元由α-D-Gal和β-D-Glc构成,按1→4方式结合;分支结构由α-D-Man以1→2结合而成,非还原性末端为α-D-Glc残基以1→4的结合方式与α-D-Man结合。通过甲基化分析,α-D-Glc(1→大约占中葡萄糖残基的20%左右,由此可以推断MEPN-B-Ⅱ中每一个重复单元可能存在2个支链结构,一个分支是由α-D-Man构成,末端连接α-D-Glc。SEM扫描结果表明,MEPN-B-Ⅱ聚合体中每个单元为近微球的椭圆形状,紧凑堆积在一起,无规则