MLL重排白血病人源化小鼠模型的建立及系别转换的研究

MLL重排白血病人源化小鼠模型的建立及系别转换的研究背景及目的:MLL基因重排是儿童和成人白血病中常见的遗传学异常,MLL重排白血病具有独特的生物学和临床特征,已成为急性白血病的一种独立亚型。然而,目前我们对MLL-r白血病的病因、发病机制及其系别转换的原因等问题尚不十分明确。本研究以MLL-r急性白血病中常见的MLL-AF9融合基因为研究对象,通过逆转录病毒感染人胚胎肝脏造血干细胞或成人骨髓造血干细胞,并移植入免疫缺陷小鼠,建立MLL-AF9白血病人源化小鼠模型;同时利用该模型探讨微环境(细胞因子)和靶细胞(胚胎造血干细胞、成人骨髓造血干细胞)对MLL-r白血病系别决定、转换的影响。方法:1.通过MLL-AF9逆转录病毒感染不同来源(人胚胎和健康成人骨髓)的CD34+造血干细胞,并植入NSG或NSG/SGM3免疫缺陷小鼠,建立MLL-AF9白血病人源化小鼠模型。2.通过细胞形态学和流式细胞术等多种方法明确上述人源化小鼠模型中MLL-AF9白血病的类型,比较不同来源的造血干细胞和微环境对MLL-AF9白血病系别决定的影响。3.通过高压静脉注射IL-3质粒诱导NSG小鼠表达人IL-3,并将原代MLL-AF9白血病细胞在上述NSG小鼠中传代,探讨人IL-3对MLL-AF9白血病发生、系别决定、转换的影响。4.通过Southern印迹杂交和IGH基因重排等方法,对上述MLL-AF9白血病进行克隆性分析。结果:1.MLL-AF9逆转录病毒感染人胚胎肝脏CD34+造血干细胞可在NSG小鼠诱发ALL通过MLL-AF9逆转录病毒感染人胚胎肝脏CD34+造血干细胞(以下简称MLL-AF9hFLCs),并经尾静脉注射经亚致死剂量照射的NSG免疫缺陷小鼠(以下简称MLL-AF9hFLCs-NSG),定期检测NSG小鼠一般情况及外周血白血病细胞比例。MLL-AF9hFLCs-NSG小鼠移植后中位生存时间为183.0(179.0-192.0)天,肝脏、脾脏明显增大,于外周血、骨髓、肝脏和脾脏等外周器官检测到大量GFP+白血病细胞,此类细胞形态及免疫表型与人MLL-r急性B淋巴细胞白血病高度类似,提示MLL-AF9hFLCs可在NSG小鼠诱发ALL(以下简称MLL-AF9hFLCs-NSGALL)。将上述MLL-AF9hFLCs-NSG小鼠的骨髓中的ALL细胞在NSG小鼠中传代,结果显示大于等于5×102的细胞即可在第二代NSG小鼠中诱发ALL,且白血病细胞形态、免疫表型均与原代MLL-AF9hFLCs-NSGALL一致。2.MLL-AF9hFLCs可在NSG/SGM3小鼠诱发AML将与结果1中相同的MLL-AF9hFLCs经尾静脉注射入经亚致死剂量照射的可表达人IL-3、SCF和GM-CSF的NSG/SGM3免疫缺陷小鼠(以下简称MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3)。MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3小鼠移植后中位生存时间为34.0(34.0-36.0)天,肝脏、脾脏明显增大,于外周血、骨髓、肝脏和脾脏等器官检测到大量GFP+白血病细胞,其细胞形态及免疫表型与人MLL-r急性髓系白血病高度类似,提示MLL-AF9hFLCs可在NSG/SGM3小鼠诱发AML(以下简称MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML)。将不同数目的来源于MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3小鼠骨髓的AML细胞经静脉注射植入NSG/SGM3小鼠,显示AML细胞数需大于等于1×105才可能在第二代NSG/SGM3小鼠中诱发AML,其白血病细胞形态、免疫表型均与原代MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML一致。3.MLL-AF9逆转录病毒感染健康成人骨髓CD34+造血干细胞在NSG小鼠未能诱发白血病将MLL-AF9逆转录病毒感染健康成人骨髓CD34+造血干细胞(以下简称MLL-AF9aBMCs),经骨髓腔内注射植入经亚致死剂量照射的NSG小鼠(简称为MLL-AF9aBMCs-NSG)。移植后未能在MLL-AF9aBMCs-NSG小鼠外周血中检测到GFP+白血病细胞,但可以检测到小于1%的人CD45+GFP-细胞。于移植后21周行骨髓穿刺术,可以在NSG小鼠骨髓细胞中检测到人CD45+细胞(占骨髓单个核细胞比例分别为9.5%、1.8%和2.6%),且均为人CD45+GPF-细胞,并未检测到GFP+细胞。上述MLL-AF9aBMCs-NSG小鼠均健康存活至移植后第50周,安乐死处死并解剖后发现其肝脏和脾脏大小正常,外周血、脾脏和骨髓均未检测到GFP阳性细胞,但骨髓中仍可以检测到少量人CD45+GFP-细胞。4.MLL-AF9aBMCs可在NSG/SGM3小鼠诱发AML将与结果3中相同的MLL-AF9aBMCs经骨髓腔内注射植入经亚致死剂量照射的NSG/SGM3免疫缺陷小鼠(以下简称为MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3)。MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3小鼠移植后中位生存时间为99.0(84.0-113.0)天。大体解剖显示肝脏、脾脏明显增大;于外周血、骨髓、肝脏和脾脏等外周器官检测到大量GFP+白血病细胞,此类细胞形态及免疫表型与人类MLL-r急性髓系白血病细胞高度类似,提示MLL-AF9aBMCs可在NSG/SGM3小鼠诱发AML(以下简称MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3AML),但其潜伏期明显长于MLL-AF9hFLCs在NSG/SGM3小鼠诱发AML。同样,将上述MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3小鼠的骨髓AML细胞在NSG/SGM3小鼠中传代,显示输注的细胞数需大于等于5×106才可能在第二代NSG/SGM3小鼠中诱发AML,其白血病细胞形态、免疫表型均与原代MLL-AF9aBMCs-NSG/SGM3AML一致。5.静脉高压注射IL-3质粒可加速MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML细胞在NSG小鼠的植入及迁移MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML白血病细胞表面表达人IL-3受体(huIL-3R、huCD123),不表达或低表达人SCF受体(huSCFR、huCD117)和人GM-CSF受体(huGM-CSFR、huCD117)。比较MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML白血病细胞在高压静脉注射IL-3质粒的NSG小鼠和对照组NSG小鼠的致病情况,MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML可导致高压静脉注射IL-3质粒的NSG小鼠(5/5)发生白血病,3/5的小鼠在观察期内(移植后37周)死亡;对照组NSG小鼠观察期内未能在外周血检测到人GFP+白血病细胞,但4/5小鼠骨髓内长期存在人GFP+白血病细胞,5/5小鼠观察期内均健康存活。6.原代MLL-AF9hFLCs-NSG/SGM3AML细胞植入IL-3质粒高压静脉注射的NSG小鼠后可发生急性混合谱系白血病将原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML白血病细胞输入经IL-3质粒高压静脉注射的NSG小鼠,3/5小鼠发生与输注的原代细胞特征相同的AML(简称2°MLL-AF9hFLCsAML);2/5小鼠的发生MLL(简称2°MLL-AF9hFLCsMLL),即同时存在两类GFP+白血病细胞,分别为CD19+CD33-GFP+(简称2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+)和CD19-CD33+GFP+(简称2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+)白血病细胞,二者的细胞形态、免疫表型分别与ALL和AML一致。我们分别对原代及二代白血病细胞进行克隆性分析。Southern印迹杂交的结果显示原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML、2°MLL-AF9hFLCsAML、2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+和2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+具有相同的克隆起源。IGH重排结果显示2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD19+发生IGH基因重排,原代MLL-AF9hFLCsNSG/SGM3AML、2°MLL-AF9AML、2°MLL-AF9hFLCsMLL-CD33+则未检测到IGH基因重排。结论:1.利用MLL-AF9逆转录病毒感染人胚胎肝脏造血干细胞可