酶促反应的机制

关于酶促反应的机制1、趋近与定向效应(proximityandorientationeffect)邻近效应(proximityeffect)：由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，使底物在酶活性中心的有效浓度增加的效应。定向作用(orientationarrange)：当底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向，酶促反应易于进行。第2页,共98页，2024年2月25日，星期天第3页,共98页，2024年2月25日，星期天第4页,共98页，2024年2月25日，星期天邻近效应与定向效应对反应速度的影响：①使底物浓度在活性中心附近很高②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用③酶使分子间反应转变成分子内反应④邻近效应和定向效应对底物起固定作用第5页,共98页，2024年2月25日，星期天普通化学反应—随机碰撞（受浓度、碰撞角度影响）相当于——社会上的自由恋爱；酶的活性中心—相当于“婚姻介绍所”；邻近效应提高了酶的活性（“婚介”）中心底物的浓度（—非婚男女集中）；定向排列缩短了底物与催化基团间（“男女”）的距离；提高反应速度（成功率）108倍。第6页,共98页，2024年2月25日，星期天2.酸--碱催化(acid-basecatalysis）酶活性中心广义酸碱基团

广义酸基团（质子供体）广义碱基团（质子受体）pKCOOHCOONH3+NH2..NHNH2NH2+NHNHNH2..SHSO-OHNHNH+NHN3.96(Asp),4.32(Glu)10.8012.488.3310.116.00酸--碱催化：酶分子的一些功能基团，如His，Asp作为质子的受体或供体，通过瞬时向底物提供质子或从底物接受质子以稳定过渡态。第7页,共98页，2024年2月25日，星期天碱催化＋酸催化第8页,共98页，2024年2月25日，星期天第9页,共98页，2024年2月25日，星期天影响酸碱催化反应速度的两个因素⑴酸碱强度(pK值）：组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。⑵给出质子或结合质子的速度：咪唑基最快，半寿期小于10-10秒。第10页,共98页，2024年2月25日，星期天3.共价催化（covalentcatalysis）酶作为亲核基团或亲电基团，通过与底物形成过渡性的共价过渡产物，使反应活化能降低，加速反应。第11页,共98页，2024年2月25日，星期天－OH的亲核催化(胰蛋白酶)第12页,共98页，2024年2月25日，星期天某些通过共价催化机制进行的酶反应酶共价中间络合物参与共价中间络合物形成的氨基酸残基3-磷酸甘油醛脱氢酶酰基-酶CysD-氨基酸氧化酶Schiff-碱Lys乙酰CoA酰基转移酶酰基-酶CysGly咪基转移酶咪基-酶His蔗糖磷酸化酶葡糖基-酶Cys转醛醇酶Schiff-酶Lys胰蛋白酶酰基-酶Ser木瓜蛋白酶酰基-酶Ser碱性磷酸酯磷酰基-酶SerATP-柠檬酸解酶磷酰基-酶Glu果糖二磷酸醛缩酶Schiff-碱Lys磷酸葡萄糖变位酶磷酰基-酶Ser琥珀酰CoA合成酶磷酰基-酶His第13页,共98页，2024年2月25日，星期天4.酶活性中心低介电性又表面效应(surfaceeffect)。酶活性中心的疏水区域对水分子的排除、排斥，在非极性环境中可显著增高两个带电基团之间的静电作用，有利于同底物的结合；同时，酶的催化基团被低介电环境所包围，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，有利于酶加速反应的。第14页,共98页，2024年2月25日，星期天结合区可避免水分子干扰在避开水分子的干扰下，分子间的离子键才容易产生。-+第15页,共98页，2024年2月25日，星期天疏水口袋肽链底物疏水性口袋第16页,共98页，2024年2月25日，星期天第17页,共98页，2024年2月25日，星期天酶-底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。诱导底物变形，扭曲，促进了化学键的断裂。5.张力效应（straineffect）酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。第18页,共98页，2024年2月25日，星期天+

-+

-稳定的底物通过电荷等相互作用，底物张力变形激活形成过渡态

-

-++第19页,共98页，2024年2月25日，星期天第20页,共98页，2024年2月25日，星期天靠近羧肽酶催化中的电子云形变化定向极性专一性契合区H2+N＝C精氨酸C端确认区注意＋第21页,共98页，2024年2月25日，星期天6.金属离子的催化作用第22页,共98页，2024年2月25日，星期天+/-+--/+7.多元催化(multielementcatalysis)第23页,共98页，2024年2月25日，星期天接受质子：碱提供质子：酸酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或受体，从而对底物进行酸碱催化如组氨酸的咪唑基,解离常数为6.0，在生理pH下酸碱形式均可存在，很活跃

酸碱催化可参与多种反应，如多肽的水解、酯类的水解、磷酸基的转移第24页,共98页，2024年2月25日，星期天综上所述：酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核/亲电催化、一般酸/碱催化或金属离子催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。如凝乳蛋白酶：Ser-195亲核催化，His-57碱催化等。第25页,共98页，2024年2月25日，星期天A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）B.形成四联体过度态中间物四.酶催化机理实例—胰凝乳蛋白酶第26页,共98页，2024年2月25日，星期天第27页,共98页，2024年2月25日，星期天E.形成包括水分子的四联体过度中间物F.羰基产物形成，酶游离第28页,共98页，2024年2月25日，星期天第29页,共98页，2024年2月25日，星期天第30页,共98页，2024年2月25日，星期天第31页,共98页，2024年2月25日，星期天第四节、酶促反应动力学第32页,共98页，2024年2月25日，星期天

底物浓度与酶促反应速度的影响酶浓度对酶促反应速度的影响pH对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影响本节需要解决的问题第33页,共98页，2024年2月25日，星期天酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。产物0

时间初速度酶促反应速度逐渐降低第34页,共98页，2024年2月25日，星期天

酶促反应可表现为三个层级反应。反应速度对于底物浓度的变化呈双曲线，称为米氏双曲线。在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度和酶浓度成正比。一、底物浓度对酶促反应速度的影响第35页,共98页，2024年2月25日，星期天（一）、底物对酶促反应的饱和现象：第36页,共98页，2024年2月25日，星期天反应级数第37页,共98页，2024年2月25日，星期天单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。研究前提在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。（二）、曲线的基本含义第38页,共98页，2024年2月25日，星期天1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度定量关系的数学方程式。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

Vmax[S]Km+[S]V＝────（三）米氏方程（Michaelis-Mentenequation）第39页,共98页，2024年2月25日，星期天中间产物学说快速平衡理论1913年Michaelis和Meuten提出，当底物浓度远远大于酶浓度时，假定ES分解成产物的逆反应可忽略不计，因此在“快速平衡”理论的基础上推倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间的定量关系，称为米氏方程。1.基础第40页,共98页，2024年2月25日，星期天恒态法推导：

1925年Briggs和Haldame对米氏方程作了一次重要的修正，提出了恒态的概念。所谓恒态是指反应进行一定时间后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，亦即ES的净生成速度为零，此时ES的浓度不再改变，达到恒态，也称稳态。第41页,共98页，2024年2月25日，星期天（1）S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于ESP+E（2）反应在起始阶段，逆反应可忽略，反应速度取决于V＝k3[ES]（3）[S]》[E]（4）反应体系处在稳态（stablestate）：E与S迅速生成ES复合物，并达到平衡。2.前提第42页,共98页，2024年2月25日，星期天推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即[ES]恒定。K1([Et]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]K2+K3＝Km

（米氏常数）K1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([Et]－[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得：第43页,共98页，2024年2月25日，星期天当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度Vmax＝K3[ES]＝K3[Et](5)[ES]＝───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V＝────第44页,共98页，2024年2月25日，星期天底物浓度对酶促反应速度的影响[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K2[E]V=Vmax[S]Km+[S]第45页,共98页，2024年2月25日，星期天（三）Km和Vmax的意义：

1.当

=Vmax／2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度，单位是mol/L

。VmaxV[S]KmVmax/2Km＝[S]2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]第46页,共98页，2024年2月25日，星期天2.Km可以反映酶与底物亲和力的大小当K2>K3时，1/Km可近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小，酶与底物的亲和力就越大。E+S

k+1k-1k+2ESE+Pk-1+k+2k+1Km==Ks第47页,共98页，2024年2月25日，星期天3.可用于判断反应级数当[S]<0.01Km时，反应为一级反应；当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应；当0.01Km<[S]<100Km时，为混合级反应。V=Vmax[S]Km+[S]第48页,共98页，2024年2月25日，星期天4.Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。5.Km可用来判断酶的天然底物：Km值最小者，即为该酶的最适底物。米氏常数Km=(k-1+k+2)/k+1在反应的起始阶段，k+2<<k-1，Ｋm≈k-1／k+1≈１／Ｋ平≈Ｋ解离此时，Ｋm越大，说明Ｅ和Ｓ之间的亲和力越小，ＥＳ复合物越不稳定。当Ｋm越小时，说明Ｅ和Ｓ的亲和力越大，ＥＳ复合物越稳定，也越有利于反应。第49页,共98页，2024年2月25日，星期天6.可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，此时即为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。7.Vmax可用于计算酶的转换数：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。第50页,共98页，2024年2月25日，星期天某些酶的Km值酶底物Km(mmol/L)乳酸脱氢酶丙酮酸0.017己糖激酶D-葡萄糖0.05D-果糖1.5

-半乳糖苷酶D-乳糖4.0碳酸酐酶H2CO39.0过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖28糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸108第51页,共98页，2024年2月25日，星期天3.Eadie-Hofstee作图法Eadie-Hofstee方程式：v─

[S]v=KmVmax－.Vm-Km斜率=v─[S]0v2.汉斯作图法(Hanes-WoolfPlot）林－贝氏方程式：v─[S]=──KmVmax[S]Vm─1＋.方程式两边同乘以[S]

v─1=──KmVmax[S]─1Vm─1＋.[S]-KmKmVm──1Vm斜率=v─[S]0双倒数作图法（doublereciprocalplot）又林－贝氏作图法（Lineweaver-BurkEquation）经变换Vmax[S]Km+[S]v=────v─1=──KmVmax[S]─1Vm─1＋.v─1[S]─10Km─1-─1VmKmVm─斜率=（四）Km和Vmax的测定第52页,共98页，2024年2月25日，星期天eg1.若要求反应速度到达Vmax的99%，其底物浓度应为：

99%=100%[S]/（Km+[S]）∴[S]=99Km

eg2.若要求反应速度达到Vmax的90%，其底物浓度应为：

90%=100%[S]/（Km+[S]）∴[S]=90Km第53页,共98页，2024年2月25日，星期天选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量：[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时，1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。第54页,共98页，2024年2月25日，星期天注意：

米氏方程只是反映了底物单分子时酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，但这个方程不适应包括一种以上的底物和其他物质的影响的酶反应。

可以根据这个方程推出各种复杂酶促反应的动力学方程。第55页,共98页，2024年2月25日，星期天k3[E][S]Km+[S]=k3[E](Vm=K3[E])v=v[E]o二、酶浓度对反应速度的影响当反应系统中底物的浓度足够大时，反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。当[S][E]，米-曼方程式中Km可以忽略不计。第56页,共98页，2024年2月25日，星期天2．V与[E]关系的几点讨论第57页,共98页，2024年2月25日，星期天一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。三、温度对酶促反应速度的影响第58页,共98页，2024年2月25日，星期天最适温度（optimumtempe-rature）：使酶促反应速度达到最大时的温度，也即酶活性最高时的温度。最适温度因不同的酶而异，动物体内的酶的最适温度在37-400C左右。酶的最适温度与实验条件有关，它受到底物的种类、浓度;缓冲液的种类、浓度;酶的纯度;反应的温度、时间等的影响。因而它不是酶的特征性常数。第59页,共98页，2024年2月25日，星期天0102030405060℃2.01.51.00.5温度对唾液淀粉酶活性的影响产物麦芽糖的毫克数第60页,共98页，2024年2月25日，星期天温度对酶促反应速度的影响第61页,共98页，2024年2月25日，星期天低温的作用:贮存生物制品、菌种等

低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉减少组织细胞的代谢程度，使机体耐受手术时氧和营养物质的缺乏

第62页,共98页，2024年2月25日，星期天观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一“钟形”曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH(optimumpH)。四、pH对酶促反应速度的影响第63页,共98页，2024年2月25日，星期天5678

9

1011最适pH

RelativeActivity第64页,共98页，2024年2月25日，星期天第65页,共98页，2024年2月25日，星期天人体内大多数酶的最适pH在6.5～8.0之间。酶的最适pH不是酶的特征性常数，与酶的性质、底物和缓冲体系有关。pH对酶促反应速度的影响，其原因主要是由于pH的改变导致了酶的催化基团以及底物分子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。第66页,共98页，2024年2月25日，星期天一些酶的最适pH值酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8碱性磷酸酶

10.5第67页,共98页，2024年2月25日，星期天问题：（1）

Km越小，底物亲和力越大（X）（2）

Ks越小，底物亲和力越大（√）（3）

天然底物就是亲和力最大的底物（X）（4）

天然底物就是Km值最小的底物（√）（5）底物亲和力越大酶促反应速度越大（X）（6）对于不同的酶或同一种酶的不同底物，Km越小反应速度越大（X）第68页,共98页，2024年2月25日，星期天酶的抑制作用有些物质能与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失。失活作用凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。抑制剂凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂(inhibitor)。五、抑制剂对反应速度的影响第69页,共98页，2024年2月25日，星期天酶的抑制与变性的区别：

抑制剂对酶的抑制作用有选择性，而蛋白质变性剂可使所有的酶变性失活。酶抑制剂一般都具有以下特点：一方面在化学结构上与被抑制酶的底物分子或底物的过渡态相似。另一方面能够与酶的活性中心以非共价键或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。第70页,共98页，2024年2月25日，星期天(一)不可逆抑制（irreversibleinhibition）不可逆抑制：抑制剂与酶分子的必需基团共价结合,使酶丧失活性,不能采用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。[E]

[I]第71页,共98页，2024年2月25日，星期天1、巯基酶抑制剂抑制剂：重金属离子Ag+、Hg2+、砷剂等，以丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶巯基酶失活的酶分子第72页,共98页，2024年2月25日，星期天

SEHg+SCOONaCHSHCHSHCOONa

SHE+HgSHCOONaCHSCHSCOONa二巯基丁二酸钠解毒方法：第73页,共98页，2024年2月25日，星期天2、羟基酶抑制羟基酶指有丝氨酸残基侧链上的羟基为必需基团的一类酶。抑制剂：有机磷杀虫剂，如：敌百虫、敌敌畏、对硫磷等。解毒------解磷定(PAM)丝氨酸酶第74页,共98页，2024年2月25日，星期天乙酰胆碱+H2O胆碱+乙酸胆碱酯酶有机磷杀虫剂×胆碱能神经兴奋↑中毒（心跳变慢、瞳孔缩小、流涎、多汗、呼吸困难）第75页,共98页，2024年2月25日，星期天3.自杀底物(suicidesubstrate)底物在酶催化作用下所形成的反应中间物或最终产物，可以共价修饰酶活性部位的必需基团从而导致酶不可逆失活。第76页,共98页，2024年2月25日，星期天（1）天然酶的自杀底物AckeeBlighiasapida植物——未成熟果实的假种皮中含有一种有毒的降糖氨酸（即甲叉环丙基丙氨酸）第77页,共98页，2024年2月25日，星期天（2）治疗用人工合成的酶自杀底物治疗高血压；癫痫；抗青霉素的菌株；在肿瘤治疗上；治疗震颠麻痹症；痛风症的自杀底物疗法。第78页,共98页，2024年2月25日，星期天（二）可逆抑制作用：抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。[E]

[I]可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性、和非竞争性抑制几种类型。

第79页,共98页，2024年2月25日，星期天1.竞争性抑制（competitiveinhibition)：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低第80页,共98页，2024年2月25日，星期天SSEEIIEE+P无I

有I

竞争性抑制的底物浓度曲线v竞争性抑制作用过程[S]第81页,共98页，2024年2月25日，星期天+IEIk+3酶的竞争性抑制反应模式k-3k+2E+SE+PESk+1k-1第82页,共98页，2024年2月25日，星期天竞争性抑制的动力学方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax竞争性抑制的的双倒数图形特征：

[I]正常1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km第83页,共98页，2024年2月25日，星期天⑴竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物⑵抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同⑶抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小⑷动力学参数：Km值增大，Vm值不变

竞争性抑制的特点：第84页,共98页，2024年2月25日，星期天竞争性抑制剂有：丙二酸、草酰乙酸等琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制第85页,共98页，2024年2月25日，星期天I：磺胺药S：对氨基苯甲酸（PABA）磺胺类药物的竞争性抑制——二氢叶酸合成酶磺胺药与PABA相互竞争与FH2合成酶结合第86页,共98页，2024年2月25日，星期天第87页,共98页，2024年2月25日，星期天抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低2.非竞争性抑制（non-competitiveinhibition）SSEEEE+PSESIIII第88页,共98页，2024年2月25日，星期天k-3k+3+IESIk+2E+PESE+Sk+1k-1k-3k+3+IEI+Sk+1k-1非竞争性抑制的图形特征反应模式第89页,共98页，2024年2月25日，星期天非竞争性抑制的动力学方程:1v=KmVmax(1+

)+[I]Ki1[S]1Vmax（1+）[I]Ki非竞争性抑制的双倒数图形特征：1v正常

[I]1[S]-1Km1Vmax(1+)[I]Ki第90页,共98页，2024年2月25日，星期天⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响⑷动力学参数：