扎伊尔埃博拉病毒PCR检测试剂盒使用方法

/扎伊尔埃博拉病毒PCR检测试剂盒使用方法扎伊尔埃博拉病毒PCR检测试剂盒说明书产品特征:灵敏度高：能对低拷贝或多样性模板进行定量。特异性强：采纳热启动酶的激活机制，抑制非特异性扩增。重复性好：扩增曲线重合度高，受干扰影响少。扩增效率高：扩增曲线Ct值低，起峰快，效率高。原理:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。需要自备的器材：1．仪器：分析天平、离心机、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、20℃冰箱、可调移液器（2L、20L、200L、1000L）。2．耗材：荧光PCR反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5mL经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、吸头（10L、200L、1000L）、灭菌双蒸水。具有下列特点：1.产品仅用于科研即开即用，用户只需要供给样品DNA模板，操作简单，定量精准快速。2.引物经过优化，特异性强。预期的PCR产物长度为560bp。3.PCRmix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。4.供给阳性对比，便于分析试验结果。检测方法：1.Ⅰ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的加添与PCR产物的加添wan全同步。定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团汲取；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，产品仅用于科研使报告荧光基团和淬灭荧光基团分别，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成wan全同步。荧光定量PCR试验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其wan全溶解。②两相分别每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动猛烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中心层以及无色水相上层。RNA全部被调配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥当心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥510分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其wan全溶解，获得的RNA溶液保存于80℃待用。1）紫外汲取法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的汲取值，测定RNA溶液浓度和纯度。反应五要素：斯氏分枝杆菌PCR检测试剂盒费用参加PCR反应的物质重要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵从以下原则：①引物长度：1530bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以4060%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易显现非特异条带。ATGC随机分布，避开5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避开引物内部显现二级结构，避开两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避开因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适合的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可加添引物之间形成二聚体的机会。试验注意事项：1）RTPCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料，不同的样本有不同要求，试验前请充分沟通确认试验方案和样本情况；2）客户尽可能供给试验的背景信息、物种、基因精准的名称和ID号；3）客户尽量不要供给DNA或RNA样品。4）样本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。实时荧光定量PCR（quantitativerealtimePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，*通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的加添，非探针类是利用荧光染料