医学微生物学课件

病毒與宿主的相互關係

第一節病毒感染及病毒性疾病病毒感染：病毒侵入體內並在靶器官細胞中增殖，與機體發生相互作用的過程為病毒感染(viralinfection)。病毒性疾病：感染後常因病毒種類、宿主狀態不同而發生輕重不一的具有臨床表現的疾病，稱為病毒性疾病(viraldisease)。

有時雖發生病毒感染，但並不形成損傷或疾病。

一、病毒侵入機體的途徑下述兩種途徑所引發的感染，具有特殊重要意義：一是非胃腸道途徑感染(par—enteralinfection),包括經過注射、輸血、器官移植等處置，病毒經血感染，如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等；二是親代和子代間的垂直傳播(vertcalinfection)，即存在於母體的病毒，經過胎盤或產道進入胎兒或新生兒體內形成感染，如風疹病毒、巨細胞病毒等。垂直感染，常導致先天性病毒感染綜合征、先天性畸形、流產、死胎或早產等。垂直傳播不同於水準傳播。水準傳播是指在人群個體之間的傳播，包括人與人，也包括經由媒介動物參與的傳播。二、病毒在機體內的播散

侵人機體的病毒，按一定方式呈不同程度的播散。局部播散:病毒只在入侵部位感染細胞局部播散。血行播散：病毒可在入侵局部增殖進入血液經血流或神經系統向全身或遠離入侵部位的器官播散。

第一次病毒血症、第二次病毒血症。神經播散：HSV、VZV、狂犬病病毒。三、致病性及毒力致病性：某一病毒感染某種特定的宿主(人或動物)並引起疾病時，表明此病毒對該宿主有致病性。毒力：反映病毒引起產生症狀和病理變化的強弱。病毒毒力強弱取決宿主和病毒兩方面的因素。四、病毒感染的類型

機體感染病毒後

1.按有無臨床症狀，可分為隱性感染和顯性感染。

2.依病毒感染後在機體內滯留的時間長短，分為急性感染和持續性感染。

3.持續性感染根據發展和預後又分為慢性感染、潛伏感染、慢發病毒感染和急性感染的遲發併發症。（一）隱性病毒感染與顯性病毒感染1.隱性病毒感染

病毒進入機體後不引起臨床症狀的感染，對組織和細胞的損傷不明顯。相關因素：病毒毒力弱、機體防禦能力強、病毒種類、病毒的性質。病毒仍可在體內增殖並向外界播散病毒，可成為重要的傳染源。隱性感染者雖不出現臨床症狀，但仍可獲得免疫力而終止感染。

病毒攜帶者：有部分隱性感染者一直不產生對此種病毒的免疫力叫病毒攜帶者，無症狀，但病毒可在體內增殖並向外界排泄播散，也是重要的傳染源。

有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等進入機體，到達靶細胞後大量增殖，使細胞和組織損傷，機體出現明顯的臨床症狀，這樣的感染稱為顯性病毒感染或臨床感染；按症狀出現早晚、持續時間的長短以及病毒在體內持續存在狀態等顯性感染又分為急性病毒感染和持續性病毒感染兩種。

2.顯性病毒感染（二）急性(病原消滅型)病毒感染

病毒侵入機體後，在細胞內增殖，經數日以至數周的潛伏期後突然發病。在潛伏期內：1、病毒增殖到一定水準，由靶細胞的損傷和死亡而導致組織器官的損傷和功能障礙，出現臨床症狀。2、宿主動員非特異性和特異性免疫因素清除病毒。宿主一般能在症狀出現一段時間內，把病毒清除掉而進入恢復期。特點：為潛伏期短，發病急，病程數日至數周。病後常獲得特異性免疫。因此，特異性抗體可作為受過感染的證據。（三）持續性病毒感染

病毒可在機體內持續存在數月數年數十年。可出現症狀，可不出現症狀而長期帶病毒，成為重要的傳染源。持續性病毒感染有病毒和機體兩方面的因素：機體免疫功能低下，無力完全清除病毒；病毒存在於受保護的部位或病毒發生突變,可以逃避宿主免疫作用；某些病毒的抗原性弱，難以產生免疫應答；有些病毒在感染過程中產生DIP，干擾病毒的增殖，因而改變病毒的感染過程，形成持續性感染；病毒基因整合在宿主細胞的基因組中，長期與宿主細胞共存。持續性感染有下述四種類型：1．潛伏性病毒感染(latentviralinfection)2．慢性病毒感染（chronicviralinfection）3．慢發病毒感染(slowvirusinfection)或稱遲發病毒感染(delayedviralinfection)4．急性病毒感染的遲發併發症（delayedcomplicationafteracuteviralinfection）1.潛伏性病毒感染

經急性或隱性感染後，病毒基因組存在於一定組織或細胞內，但並不能產生有感染性的病毒體。在某些條件下病毒被啟動而急性發作，病毒僅在臨床出現間歇性急性發作時才被檢出。在非發作期，用一般常規法不能分離出病毒。

例如，單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）感染

水痘帶狀皰疹病毒（VZV）感染初次感染主要在兒童引起水痘。病癒後，病毒潛伏在脊髓後根神經節或顱神經的感覺神經節細胞內。當局部神經受冷、熱、壓迫或X線照射以及患腫瘤等機體免疫功能下降時，潛伏的病毒則活化、增殖，沿神經幹擴散到達皮膚發生帶狀皰疹。隨著機體免疫功能的完善，帶狀皰疹可治癒，病毒又潛伏回原處，所以帶狀皰疹可在同一部位反復發作。2.慢性病毒感染經顯性或隱性感染後，病毒並未完全清除，可持續存在於血液或組織中並不斷排出體外，病程長達數月至數十年。患者可表現輕微或無臨床症狀。如乙型肝炎病毒（HBV）、巨細胞病毒（CMV）及EB病毒（EBV）等常形成慢性感染。3.慢發病毒感染

病毒感染後潛伏期很長可達數月、數年甚至數十年之久。此時機體無症狀，也分離不出病毒。一旦發病出現慢性進行性疾病，最終常為致死性感染。如：AIDS、羊瘙癢病（scrapie）、人克雅病（CJD）、庫魯病（Kuru）等。庫魯病是朊病毒感染機體後，經過長達數十年的潛伏期後，引起的一種進行性小腦退行性疾病。4.急性病毒感染的遲發併發症

急性感染後1年或數年，發生致死性的病毒病，如亞急性硬化性全腦炎（SSPE）。該病是在兒童期感染麻疹病毒後，有些到青春期才表現為中樞神經系統疾病，用電鏡在腦組織中可查到類似麻疹病毒樣顆粒。有人認為這是麻疹病毒的缺陷病毒。五、病毒的致腫瘤作用DNA病毒：（1）乙型肝炎病毒（HBV）與原發性肝癌有關；（2）EB病毒（EBV）與鼻咽癌、非洲兒童惡性淋巴瘤有關；（3）人乳頭瘤病毒（HPV）與子宮頸癌有關。RNA病毒：只有逆轉錄病毒科與癌症有關。

人類T細胞白血病病毒(HTLV-I型)。

第二節病毒的致病機制

病毒能否感染機體引起疾病取決於病毒的致病性和宿主免疫力兩個方面。其致病的基礎是病毒在宿主細胞內增殖，導致宿主細胞結構和功能改變，並擴延到多數細胞，便可形成組織器官的損傷及功能障礙。由於各種病毒侵犯的靶器官不同，常表現出具有一定特徵的臨床症狀。在病毒和機體細胞相互作用過程中，機體的免疫應答有時也可對機體造成某些免疫病理性損傷，介導疾病的發生與發展。因此，應從細胞和機體兩個水準上來探討病毒的致病機制。一、病毒感染引起宿主細胞的變化

病毒對細胞的致病作用包括來自病毒的直接損傷和機體免疫病理應答兩個方面。敏感的宿主細胞被病毒感染後，兩者相互作用下可表現為：殺細胞性感染穩定狀態感染細胞凋亡包涵體的形成細胞增殖和轉化病毒基因的整合

（一）殺細胞性感染

病毒在宿主易感細胞內增殖造成細胞破壞與死亡，這種感染稱殺細胞性感染。病毒在細胞內增殖引起細胞變性、死亡裂解的作用稱病毒的細胞病變效應（CPE）。機制：病毒的早期蛋白影響宿主細胞病毒蛋白的毒性作用引起細胞內溶酶體膜破裂細胞膜受體破壞引起細胞免疫病理損傷對細胞器造成損傷病毒培養時出現的CPE

(二)穩定狀態感染

一些不具有殺細胞效應的病毒（多為有包膜病毒）所引起的感染稱穩定狀態感染(steadystateinfection)。病毒在感染宿主細胞的過程中，對細胞代謝、溶酶體膜影響不很大。成熟的病毒多以出芽方式釋放出來，其過程緩慢、病變輕微，細胞暫時還不會出現裂解和死亡，但可發生宿主細胞膜受體被破壞、細胞膜成分發生變化，出現細胞融合及細胞表面產生新的抗原等。1.細胞融合：感染與未感染的細胞融合，可以使病毒從感染的細胞直接進入相鄰的正常細胞，有利於病毒在細胞間的擴散。2.細胞膜出現新抗原：病毒在細胞內增殖過程中，將病毒基因編碼的蛋白質插入細胞膜表面，導致細胞膜表面抗原的改變。有利於進行病毒感染的診斷。（三）細胞凋亡

細胞凋亡（cellapoptosis）是由細胞基因自身指令發生的一種生物學過程。實驗研究證實有些病毒（腺病毒、人免疫缺陷病毒等）增殖可直接誘導細胞凋亡，也可通過病毒基因組編碼的蛋白質間接作用下誘發細胞凋亡。（四）包涵體的形成

某些受病毒感染的細胞內，用普通光學顯微鏡可看到有與正常細胞結構和著色不同的圓形或橢圓形斑塊，稱為包涵體（inclusionbodyoribclusion）。因病毒種類不同，包涵體有位於胞漿內的(痘病毒)，也有在細胞核內的(皰疹病毒)；或者兩者都有(麻疹病毒)；有嗜酸性的或嗜鹼性的。包涵體的本質：①有些病毒的包涵體就是病毒顆粒的聚集體；②有些是病毒增殖留下的痕跡；③病毒感染引起的細胞反應物。故可作為診斷依據和鑒定病毒的參考。如從可疑為狂犬病的腦組織切片或塗片中發現細胞內有嗜酸性包涵體，即內基小體(Negribody)，可診斷為狂犬病。（五）細胞轉化增生和病毒基因組的整合某些DNA病毒的全部或部分核酸，或RNA病毒基因組經逆轉錄後產生的DNA，結合至細胞染色體中，稱為整合。整合作用可使細胞遺傳性狀發生改變，即轉化（transformation）。轉化的細胞生長、分裂失控，細胞可發生惡性變。二、病毒感染引起的機體變化

(一)組織器官的損傷及組織器官的親嗜性

病毒對細胞的殺傷作用，在大多數情況下，必然導致組織和器官的損傷和功能障礙。病毒對人體組織的致病作用是有選擇性的。例如，流感病毒和鼻病毒對呼吸道粘膜有親嗜性；天花病毒和皰疹病毒對皮膚粘膜細胞有親嗜性；而腦炎病毒和脊髓灰質炎病毒則對神經組織具有親嗜性。（二)免疫病理損傷1．體液免疫病理作用

許多病毒如狂犬病病毒、HSV、流感病毒等有包膜病毒侵入細胞後，能誘發細胞表面出現新抗原。這種抗原與特異性抗體結合後，在補體參與下引起細胞的破壞。2．細胞免疫病理作用

細胞免疫在某些病毒感染的恢復上起著重要作用。但特異性細胞毒性T細胞(CTL)可以同時損傷受病毒感染而出現膜新抗原的靶細胞。病毒蛋白亦可因與宿主細胞的某些蛋白間存在共同抗原性而導致自身免疫應答。

由於某些病毒可引起免疫病理性損傷，因此，一般在臨床上不宜應用免疫功能增強劑治療這類疾病。綜上，病毒感染早期所致細胞損傷主要是病毒引起，感染後期由免疫複合物、補體活化、ADCC作用、CD4+T細胞介導的複雜反應引起機體局部組織器官的嚴重損傷和炎症。(三)病毒感染對免疫系統的影響

1．病毒感染引起的免疫抑制

許多病毒感染可引起暫時性免疫抑制。如麻疹病毒、風疹病毒、CMV等感染，急性期和恢復期患者外周血淋巴細胞對特異性抗原和促有絲分裂原(PHA、ConA）的反應減弱。同時，對結核菌素皮膚試驗也出現轉陰的情況。2．病毒感染對免疫活性細胞的殺傷

已發現引起AIDS的人類免疫缺陷病毒(HIV）對輔助性T細胞(CD4＋)具有強親和性和殺傷性。因而在感染者出現CD4＋細胞減少，CD8+細胞數相對增多，兩種細胞比值倒置的現象。3．病毒感染引起自身免疫性疾病

隱蔽在細胞內的一些抗原暴露或釋放出來；病毒抗原也可能與機體細胞結合，改變細胞表面結構成為“非已物質”，這些細胞可成為靶細胞而受到免疫細胞和免疫因數的作用，從而發生自身免疫性疾病。第三節抗病毒免疫一、非特異性抗病毒免疫

(一)先天不感受性

主要取決於細胞膜上有無病毒受體。

(二)屏障作用

解剖學屏障

如皮膚粘膜屏障、血腦屏障、胎盤屏障等。

生物化學屏障

這主要是存在於正常人或動物血清和體液中的非特異抑制物，如補體系統中的某些成分能增強對病毒的中和作用。

血腦屏障能阻擋病毒經血流進入中樞神經系統。可以保護絕大多數脊髓灰質炎患者不發生麻痹。

胎盤屏障

巨噬細胞(Mф)對阻止病毒感染和促使病毒感染的恢復具有重要作用。初生小鼠由於缺乏Mφ，對HSV容易產生全身感染。給初生小鼠輸入成年鼠的Mφ，可增強對HSV感染的抵抗力。因此，含有大量Mф的器官，如肝、脾、骨髓以及淋巴組織，在阻止病毒在體內擴散方面具有重要作用。

中性粒細胞雖也能吞噬病毒，但不能將其殺滅，病毒在其中還能增殖，反而將病毒帶到全身，引起擴散。

自然殺傷(NK)細胞能殺傷許多病毒感染的靶細胞。（三）細胞作用(四)干擾素及其作用

干擾素（interferon，IFN）干擾素由病毒或其他IFN誘生劑誘使人或動物細胞產生的一類糖蛋白。它作用於機體細胞可表現出抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等多方面的生物活性。1．IFN的性質與種類

干擾素分子量小，4℃可保存較長時間，-20℃可長期保存活性，56℃可滅活。也可被蛋白酶破壞。其抗病毒作用無特異性，但IFN具有種屬特異性。由人類細胞產生的IFN，按其抗原性分成3類，即白細胞IFN(IFNα)、成纖維細胞IFN(IFNβ)和T淋巴細胞IFN(IFNγ)。IFNα和IFNβ又稱為I型IFN，IFNγ又稱為II型或免疫IFN，是一種細胞因數。IFN與抗體或免疫球蛋白(Ig)不同，干擾素的抗病毒作用無特異性。

2．IFN誘生的機理

病毒和PolyI：C以及細菌的內毒素均具有誘生I型IFN的作用。其中，RNA病毒的誘生作用比DNA病毒強。II型IFN誘生物是促有絲分裂素PHA、ConA和各種抗原。IFN的誘生受基因控制。人和動物細胞的I型IFN基因定位於第9對染色體上，II型IFN基因位於第12對染色體上。在正常情況下，存在於細胞核內的IFN結構基因處於抑制狀態，不產生IFN。這種抑制狀態是由基因系統中的調節基因通過產生IFN結構基因抑制蛋白來實現的。它抑制了操縱基因的作用，因而結構基因就處於抑制狀態。當IFN誘生劑進入細胞後，即與抑制蛋白相結合而使其失去抑制作用，因而操縱基因和結構基因的功能就被活化，指導IFN的合成。3．IFN的作用機理

在細胞內合成的IFN不能直接作用於病毒，而是作用於鄰近細胞的IFN特異的受體系統，使位於人體細胞的第21號染色體上長臂遠端的抗病毒蛋白(AVP)基因解除抑制，轉錄並翻譯出AVP。合成過程中的細節雖尚不清楚，但已知這些蛋白質包括蛋白激酶(RPK)，2’－5’A合成酶和磷酸二脂酶，分別從降解mRNA、抑制病毒蛋白質的翻譯等方面發揮抗病毒作用。4．IFN的生產和應用

人的IFN是人體細胞在IFN誘生物作用下分泌的自我穩定因素。實驗證明，輸入外源性IFN可以阻止病毒感染發生。也可應用於一些病毒皮膚粘膜感染的治療：如皰疹性角膜炎、腺病毒引起的流行性角結膜炎，用IFN點眼治療；對流感病毒等所引起的呼吸道感染，應用IFN滴鼻及噴霧法治療，均收到了較好的效果。在體外誘生IFN需要大量的人血細胞或扁桃體等淋巴組織，來源有限，效價也難達到臨床應用水準。應用基因工程方法，把人IFN基因重組到質粒中，隨著大量培養工程生產菌，可獲得預期的人IFN基因工程產品。我國基因工程生產的IFN現已在正臨床應用。二、特異性抗病毒免疫

（一）體液免疫的抗病毒作用

受病毒感染後，機體即可產生特異性抗體，按其作用可分為中和性抗體(neutralizingantibodies，NTAb)、補體結合抗體（complementfixationantibodies,CFAb）及血凝抑制抗體（heamagglutinationinhibitionantibodies,HIAb）等。這些抗體主要是IgG、IgM和IgA。NTAb能消除病毒的感染性，是唯一具有保護作用的抗體。CFAb、HIAb一般沒有保護作用，可用於血清學診斷。1．NTAb的作用機理

NTAb是針對病毒表面抗原的抗體。它與病毒表面的抗原決定簇結合，使病毒失去吸附和穿入的能力，但不能直接滅活病毒。更不能對已進入細胞內的病毒發揮作用。有時，NTAb反倒可以促進病毒進入宿主細胞及增強病毒的複製，此即抗體依賴病毒增強作用，如登革病毒的中和抗體。NTAb的抗病毒作用，主要是預防感染的發生及蔓延。2．具有抗病毒作用的免疫球蛋白(Ig)IgG

約占Ig的35％，是主要的NTAb，又是唯一可通過胎盤的Ig。一般生後6個月以內的嬰兒，因體內保留有健康母親通過胎盤傳給的各種IgG，這一期間很少患病毒性傳染病。IgM

分子量大，是多聚體Ig，出現於病毒感染或疫苗接種後的早期，有中和作用但不如IgG強。因其出現於機體感染早期，並且消失較快，故檢出特異性IgM，可做為在近期已發生感染的標誌，可做為胎內病毒感染的證據。IgA

呼吸道和消化道粘膜產生的分泌型IgA(sIgA)，可在局部發揮抗病毒作用。3．抗體對靶細胞的作用（1）對靶細胞的傷害

抗體除可中和游離狀態的病毒外，對於表面有病毒編碼抗原的靶細胞也具有促進被溶解(有補體參加)和促進被吞噬(調理)的作用。（2）ADCC機制

NK細胞也可依賴抗體協助而發揮殺傷靶細胞的作用，稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)。這一免疫機制只需少量特異性抗體。（二）細胞免疫的抗病毒作用

細胞免疫在抗病毒中起著重要作用，可從各種先天性免疫異常患者對病毒感染的抵抗力的差異加以證明。已觀察到細胞免疫功能正常而免疫球蛋白缺陷的低丙種球蛋白血症的個體，在感染病毒時，常可與正常小兒表現相同的經過而治癒。與此相反，免疫球蛋白產生正常、細胞免疫缺陷的個體,感染病毒時，常出現嚴重的後果，甚至連接種痘苗亦可發生疾病。在實驗中也證實，摘除胸腺的小鼠或無胸腺的裸鼠，對病毒感染的抵抗力明顯減弱。（三）抗病毒免疫應答的形成和持續時間

病毒感染發生後，干擾素隨病毒在細胞內複製而形成，成為機體抗病毒的早期因素，但維持時間較短。特異性抗體一般在感染1w後上升。其中IgM較早，消失較快。隨後產生的IgG，可長期維持高效價，對防止再感染具有重要的作用。

抗病毒免疫持續時間的長短在各種病毒之間差異很大。能引起持久免疫的病毒有：水痘、天花、乙型腦炎、腮腺炎、麻疹、脊髓灰質炎病毒等。僅引起短暫免疫的病毒有：流感病毒、鼻病毒等。流感病毒感染不產生牢固免疫的另一原因是易發生變異，而鼻病毒則因血清型別多(已有100多個血清型)，通過感染所建立起的免疫，對其他型病毒無免疫作用。（四）免疫病理作用

病毒誘生的免疫應答除引起免疫保護作用外，還可引起一定的免疫病理作用。如CTL在殺傷病毒感染的靶細胞同時，也造成了細胞損傷。抗病毒的抗體如因親和力低或與抗原的比例不當，可在體內形成抗原抗體複合物的沉積而引起Ⅲ型超敏反應。宿主細胞膜的抗原性改變，使“隱蔽抗原表位”的暴露，可誘發自身免疫病。例如慢性肝炎患者中有部分患者存在針對肝細胞蛋白的自身抗原或細胞免疫，在麻疹病毒、腮腺炎病毒感染後期可發生腦炎。由於腦組織中不能分離出病毒，說明發生腦炎的機制並非由病毒複製所造成的損傷，而可能因病毒改變了腦組織抗原或因存在交叉抗原誘生了免疫應答，而造成腦組織損傷。病毒感染的診斷與防治

常用的病毒學診斷方法包括：病毒的分離鑒定病毒的血清學檢查病毒蛋白和核酸的檢測第一節病毒感染的診斷一、標本的採取與送檢應注意下列原則：1.對本身帶有雜菌(如咽拭子、糞便)或易受污染的標本，要進行病毒分離培養時，應使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保存並儘快送檢。3.血清學診斷標本的採取應在發病初期和病後2～3w內各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態變化。二、病毒的分離與鑒定(一)病毒的分離1.動物接種是最原始的病毒培養方法，根據病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經性病毒（狂犬病毒）可接種於小鼠腦內，痘病毒可接種於家兔角膜或皮內。

2.雞胚培養雞胚對多種病毒敏感。一般採用孵化9～14天的雞胚，根據病毒種類不同，將病毒標本接種於雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。3.組織培養法(tissueculture)或細胞培養(cellculture)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養的技術總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。細胞的變化有些病毒在細胞內增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應(CPE)。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用於細胞膜，可使鄰近的細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養細胞中形成胞漿或核內的包涵體。病毒在培養細胞中增殖的指標病毒培養時出現的CPE2.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞後，由於細胞膜上出現了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物(豚鼠、雞、猴等)紅細胞的能力，這一現象稱紅細胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應的抗血清，則能中和細胞膜上的HA，HAd不再發生，稱紅細胞吸附抑制試驗。3.干擾現象(interference)某些病毒感染細胞時不出現CPE或其他易於測出的變化(如HAd)，但能幹擾在其後感染的另一病毒的增殖。如風疹病毒感染Vero細胞時CPE不明顯，但它能幹擾後感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，從而阻抑後者所特有的CPE。4.細胞代謝的改變病毒感染細胞的結果可使培養液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染後發生了變化。這種培養環境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。(二)病毒的數量與感染性測定

1.蝕斑測定是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養瓶中。病毒吸附後，再覆蓋一層融化的半固體營養瓊脂，使病毒在單層細胞培養中有限擴散。結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。2.50%組織細胞感染量(TCID50)測定法該方法是測定病毒能使50%的組織培養細胞發生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經一定時間後觀察CPE、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞的量為終點。最後用統計方法計算出50%組織細胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。三、病毒感染的血清學診斷原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應抗體，故須待病人感染後體內產生抗體時才能檢出。另外，在採取臨床標本及病人血清應注意病程，必須採取患者急性期血清與恢復期血清(雙份血清)進行血清學試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。1.中和試驗(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活體內或細胞培養中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。中和抗體(netralizingantibodies,NTAb)是作用於病毒表面抗原(衣殼或包膜)的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用於人群免疫情況的調查，在臨床診斷上較少使用。2.補體結合試驗

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原來檢測病人血清中相應(CF)抗體。CF抗原是病毒的內部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗低。但CF抗體出現較早，消失較快，故CF陽性可作為近期感染的指標。3.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現象。這種現象能被相應抗體抑制，稱HI試驗。其原理是相應抗體與病毒結合後，阻抑了病毒表面的HA與紅細胞的結合。本試驗簡易、經濟，特異性高，常用於粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調查，也可鑒定病毒的型與亞型。病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）四、病毒感染的快速診斷

快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數小時內即可得出結果。(一)形態學檢查1.電鏡和免疫電鏡檢查2.普通光學顯微鏡檢查有些病毒在宿主細胞內增殖後，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現一個或數個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜鹼性的結構，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。(二)病毒蛋白抗原檢查

用螢光素、放射性同位素、過氧化物酶等標記抗體，採用免疫學和分子生物學技術，檢測標本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特異、快速等優點。1.免疫螢光技術(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測多種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)。(三)特異性IgM抗體的檢測

檢測病毒特異性IgM抗體可診斷急性感染，特別是對證實孕婦感染風疹病毒尤為重要，但應注意類風濕因數(IgM)的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑。如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等的抗體，可以區別急性或慢性EBV感染。此外，分子生物學檢測技術、氣相色譜技術等，均可用來分析和鑒定病毒感染。(四)檢測病毒核酸

1.核酸雜交技術用於病毒檢測的有斑點雜交、細胞內原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴增法目前多數病毒基因已通過分子克隆技術被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術逐步發展為常規診斷技術之一。3.基因晶片技術基因晶片又稱DNA晶片、生物晶片（biochip）。其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規模或有序排布於小塊矽片等載體上，與待測樣品中的生物分子或基因序列相互作用和並行反應，在鐳射的激發下，產生的螢光譜信號被接受器收集，電腦自動分析處理數據並報告結果。其優點是：可以一次性完成大量樣品DNA序列的檢測和分析，解決了傳統核酸雜交技術的許多不足。晶片技術在病毒等微生物學診斷和流行病學調查方面有著廣闊的應用前景。第二節病毒感染的預防一、人工自動免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常規活疫苗即減毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工選擇法(如溫度敏感株)篩選的對人低毒或無毒的變異株製成的疫苗，如脊髓灰質炎、流感、麻疹的減毒活疫苗等。2.新型活疫苗應用基因工程技術，控制病毒變異，或利用DNA重組技術，插入和定向缺失病毒基因，將保護性病毒蛋白的編碼基因插入活載體中或選擇性地去除病毒的某一個或幾個致病基因而達到減毒作用製備的可在機體內增殖，誘發抗病毒免疫應答的疫苗。(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫苗應用物理或化學方法使病毒完全滅活而製成的疫苗。常用的有乙型腦炎、狂犬病、流感等滅活疫苗。2.亞單位疫苗(subunitvaccine)製備不含有病毒核酸、僅含有能誘發中和抗體的病毒衣殼蛋白或包膜表面抗原，是最理想的疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成與病毒保護性抗原決定簇的氨基酸序列相同的肽段，製備成免疫原後免疫動物或人體，使機體產生保護性抗體4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技術，分離、重組、轉化和表達基因，製備出的能引起人體保護性免疫應答疫苗。5.DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一種細菌的質粒，在克隆了特異性的基因以後，能在真核細胞中表達蛋白質抗原，刺激機體產生特異性體液和細胞免疫。6.新型多價聯合疫苗、口服疫苗的研究減毒活疫苗與死疫苗優缺點比較特點減毒活疫苗死疫苗製備方法通過非正常培養減毒株通過化學物理方法使感染失活免疫接種一般為一次性多次免疫疫苗的穩定性相對不穩定相對穩定免疫的類型體液免疫和細胞免疫體液免疫毒力回升有可能不可能安全性對免疫缺陷者有危險安全性好生產和成本生產較複雜、成本高生產簡單、成本低二、人工被動免疫人工被動免疫的製劑有免疫血清和丙種球蛋白，或與細胞免疫有關的因數等。大多數人均受過不同種類的病毒感染，從正常血清中提取免疫球蛋白可用於緊急預防。常注射人免疫球蛋白預防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰質炎等。可使接觸病原者不出現症狀或僅出現輕微症狀。近年來有人應用含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig)預防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白時因其半衰期短，故應注意有效期。第三節病毒感染的治療一、抗病化學製劑（一）核苷類藥物核苷類藥物的作用機制有主要是抑制病毒基因複製①模擬核苷成分摻入病毒基因組：合成的異常嘧啶取代病毒DNA前體的胸腺嘧啶，病毒在複製過程中，這種異常的嘧啶分子摻入子代DNA中使子代病毒結構基因的合成和表達無法進行，從而抑制病毒的複製，或複製出的病毒為缺陷病毒。②競爭病毒複製酶1.無環鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧鳥苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韋）為鳥嘌呤或去氧鳥嘌呤核苷類似物。該藥細胞毒性很小，是目前最有效的抗皰疹病毒藥物之一。廣泛用於皰疹病毒感染引起的單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。2.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷類似物，通過阻斷前病毒DNA的合成而抑制HIV的複製，AZT對病