医学微生物学实验课件

細菌的分佈與外界因素對細菌的影響

病原生物學實驗實驗一第一部分醫學微生物學實驗課的要求四、認真分析實驗結果，探討實驗原理，得出可能的結論。若實驗結果與理論不符合時，要加以分析討論，以逐步提高自己的科學思維能力。認真分析五、實驗課後，須按時按要求遞交實驗報告。提交報告六、防止發生各種事故。防止事故一、嚴格遵守實驗室規則，嚴格執行無菌操作。無菌操作二、實驗前做好預習，做到心中有數。課前預習三、示教的實驗要仔細觀察，聯繫有關理論積極思考。仔細觀察醫學微生物學實驗課的要求01第二部分醫學微生物學實驗室規則醫學微生物學實驗室規則02一進入實驗室必須穿實驗服，必要的文具應放在抽屜裏，個人物品如書包、衣物等一律不得帶入實驗室。用過的滴管、玻片等帶菌器材，應放在指定的地方，不得將帶菌液體傾入水槽。若發生割破手指、菌液進入眼等事故時，應立即報告老師，及時進行預防處理。二三四愛護公物，節約使用實驗材料。醫學微生物學實驗室規則02五離開實驗室前，用消毒液將手浸泡5～10分鐘，並用自來水沖洗乾淨後，方可離室。值日生負責整理清潔實驗室，關好水、電、門、窗。未經許可，不得將實驗室內任何物品（特別是菌種）帶出室外。六七八實驗完畢，應清理桌面，把用過的物品放回原處（如顯微鏡、接種環、染色液等），需培養物品按要求放溫箱。第三部分實驗報告書寫0102030506040708實驗題目實驗目的實驗原理實驗結果實驗方法實驗報告書寫03實驗材料結果分析實驗意義第四部分實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響能瞭解水和空氣中細菌的分佈；能說出存在皮膚、咽喉的主要菌種；能舉出常用的皮膚化學消毒劑種類以及闡述出這些消毒劑的作用濃度和作用原理；能熟練、規範、正確地進行皮膚消毒操作。能夠理解高壓蒸汽滅菌法、紫外線滅菌法及藥物敏感實驗的原理；能熟練、規範、正確地進行高壓蒸汽滅菌、紫外線滅菌法及藥物敏感實驗；能正確判斷解釋藥物敏感實驗的結果判斷及解釋臨床意義實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響教學目標實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響實驗內容１.空氣中細菌的檢查２.水中細菌的檢查３.皮膚消毒試驗４.飛沫中細菌的檢查１.高壓蒸汽滅菌法２.紫外線殺菌試驗３.藥物敏感試驗細菌的分佈檢查一二外界因素對細菌的影響實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響細菌的分佈檢查一、細菌的分佈檢查目的：瞭解微生物在自然界及正常人體的分佈，對於在醫療實踐及科學實驗中樹立無菌觀念有著重要的意義。

材料：普通瓊脂平板血瓊脂平板

MH瓊脂平板３７℃溫箱無菌棉簽等普通瓊脂平板血瓊脂平板實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（一）空氣中細菌的檢查（示教）細菌的分佈檢查未被過濾空氣中的細菌菌落過濾後空氣中的細菌菌落實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（二）水中細菌的檢查（示教）細菌的分佈檢查取水样1ml注入无菌空平皿内融化并冷却至约45℃的培养基将15ml培养基加入平皿倒置于37℃温箱培养18-24小时观察结果實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（三）皮膚細菌的檢查1.分區標記

2.接種

3.培養細菌的分佈檢查空白對照消毒後消毒前常用的皮膚消毒劑實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（四）飛沫中細菌的檢查用咳碟法將咽喉部細菌接種於血平板細菌的分佈檢查實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響二、外界因素對細菌的影響當外界環境條件發生巨大改變，可導致微生物的主要代謝活動發生障礙，生長停頓，甚至死亡。外界因素對細菌的影響實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（一）高壓蒸汽滅菌法（示教）1.原理：利用密閉的金屬鍋，密閉加熱使鍋內蒸汽壓力增大，溫度隨之升高，殺菌力增強。外界因素對細菌的影響手提式高壓蒸汽滅菌器實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響高壓蒸汽滅菌器構造：外界因素對細菌的影響高壓蒸汽滅菌器是一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上方或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺旋，藉以緊閉蓋門，使蒸汽不能外溢，因而蒸汽壓力升高，其溫度亦相應的增高。實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響2.高壓蒸汽滅菌器使用方法外界因素對細菌的影響（1）

加水至外筒內，被滅菌物品放入內筒。（2）

蓋上滅菌器蓋，擰緊螺旋使之密閉。（3）

加熱，同時打開排氣閥門，排淨其中冷空氣，關閉排氣閥。繼續加熱，待壓力錶漸漸升至所需壓力時(103.4kPa,121.3℃)，保持壓力和溫度維持15～30min。（4）

待壓力自行降至零時，慢慢打開排氣閥，排除餘氣，開蓋取物。切不可在壓力尚未降低為零時突然打開排氣閥門，以免瓶內液體等沖出外溢。

實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響3.高壓蒸汽滅菌器用途外界因素對細菌的影響凡耐高溫和潮濕的物品，如培養基、生理鹽水、衣服、紗布、棉花、敷料、玻璃器材、傳染性汙物等都可應用本法滅菌。實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（二）紫外線殺菌試驗外界因素對細菌的影響1.原理：通過紫外線的照射，破壞及改變微生物的DNA結構，使細菌當即死亡或不能繁殖後代，達到殺菌的目的。紫外線殺菌特點優點

簡單便捷、廣譜高效、無二次污染、便於治理和實現自動化等優點。缺點穿透能力弱實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響2.材料外界因素對細菌的影響普通瓊脂平板18-24h細菌培養物紫外線燈等實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響2.方法外界因素對細菌的影響普通瓊脂平板18-24h細菌培養物紫外線燈等细菌接种于普通琼脂平板上打开皿盖，放置于紫外灯下约30cm处，用盖子盖住半边做对照，照射半小时后盖好盖子。培养實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（三）藥物敏感實驗外界因素對細菌的影響目前臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要有紙片擴散法、稀釋法、抗生素濃度法、自動化儀器等實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（三）藥物敏感實驗——標準紙片擴散法（Ｋ－Ｂ）外界因素對細菌的影響1.原理：將含有定量抗生素的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加抗生素的濃度呈對數減少,在藥物濃度到達的範圍內對此藥敏感的細菌不能生長而形成透明的抑菌圈，不同細菌形成的抑菌圈各不相同，抑菌圈的大小反映了測試菌對該藥的敏感程度，並與該藥物對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關。實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響（三）藥物敏感實驗——標準紙片擴散法（Ｋ－Ｂ）外界因素對細菌的影響2.材料菌種：葡萄球菌、大腸桿菌菌液培養基：水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）試劑：各種抗菌藥物紙片（PEN、GEN、STR、CHL)實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響3.方法外界因素對細菌的影響用灭菌棉试蘸取试验菌涂抹在MH培养基表面，要均匀涂抹3次，室温下待干燥以无菌镊子(烧灼灭菌，注意镊子要冷却）取各抗生素纸片贴于表面培养各紙片中心距>24mm,紙片距平板邊緣應>15mmPENGENSTRCHL實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響4.結果判斷外界因素對細菌的影響用毫米尺量取抑菌圈直徑，參考實驗指導表3-6的標準判讀結果，按敏感（S）、仲介（I）、耐藥（R）報告。

實驗一細菌的分佈與外界因素對細菌的影響紙片法藥敏實驗結果解釋外界因素對細菌的影響抗菌藥物耐藥（mm）仲介（mm）敏感（mm）青黴素≤28－≥29慶大黴素≤1213-14≥15鏈黴素≤1112-14≥15氯黴素≤1213-17≥18一、光學顯微鏡油鏡的使用和保護法一、光學顯微鏡油鏡的使用和保護法顯微鏡的構造顯微鏡的構造圖顯微鏡的使用方法油鏡頭的辨認顯微鏡的維護一、光學顯微鏡油鏡的使用和保護法油鏡加香柏油的原理玻璃折射率：

n=1.52香柏油折射率：

n=1.515二、細菌標本染色檢查法二、細菌標本染色檢查法

細菌個體微小，無色半透明，染色後能在顯微鏡下識別其各種不同結構，並鑒別細菌。二、細菌標本染色檢查法二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法（一）革蘭染色法

丹麥細菌學家Gram於1884年發明的一種鑒別細菌的染色法。可將細菌鑒別為革蘭氏陽性G+菌和革蘭氏陰性G-菌兩大類。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法原理1.原理（1）通透性學說革蘭氏陽性菌細胞膜的通透性比陰性菌低，進入細胞的染料和碘液結合生成沉澱，脫色劑較易通過革蘭氏陰性菌的細胞膜，將碘和染料的複合物溶解洗出，故易脫色；陽性菌細胞膜透通性低，故不易脫色。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法原理1.原理（2）等電點學說

革蘭陽性菌等電點（PI2~3）比革蘭陰性菌的等電點（PI4~5）低。在同一PH條件下，陽性菌比陰性菌所帶負電荷要多，與帶正電荷的鹼性染料結合力較牢固，不易脫色。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法原理1.原理（3）化學學說

革蘭氏陽性菌細胞內含有某種特殊化學成份，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的複合物，它能和料染一煤染劑複合物相互結合，使已著色的細菌不易脫色。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法實驗材料2.實驗材料（1）菌種培養18~24h的葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌。（2）試劑生理鹽水、革蘭氏染色液。（3）儀器及用具接種環、酒精燈、玻片、顯微鏡、香柏油等。二、細菌標本染色檢查法實驗方法3.實驗方法（1）細菌塗片標本的製作製備塗片包括塗片、乾燥、固定三步。塗片乾燥固定二、細菌標本染色檢查法細菌塗片標本的製作3.實驗方法1）塗片①接種環置於酒精燈的外焰中燒灼滅菌。二、細菌標本染色檢查法細菌塗片標本的製作3.實驗方法1）塗片②取1～2環生理鹽水（NS)置於載玻片上，接種環用火焰燒灼滅菌。二、細菌標本染色檢查法細菌塗片標本的製作3.實驗方法1）塗片③小指和手掌小魚肌側拔掉棉塞，並燒灼試管口滅菌。用已滅菌冷卻的接種環伸入試管中取適量菌，注意勿使沾有菌液的接種環觸及試管壁及試管口。二、細菌標本染色檢查法細菌塗片標本的製作3.實驗方法1）塗片④再次滅菌試管口，棉塞略加燒灼放回原處。

⑤將接種環上之菌塗於載玻片的NS上，製成的菌膜直徑約1cm左右均勻薄層。⑥接種環用火焰燒灼滅菌放回原處。注：取菌量不應過多，以免造成菌體重疊。二、細菌標本染色檢查法細菌塗片標本的製作3.實驗方法２）乾燥①室溫中自然乾燥。②加速乾燥，將標本離火焰半尺高處略烘。注：不宜離火焰過近，以免造成菌體過熱變形。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法3.實驗方法（２）革蘭染色法二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法操作步驟3.實驗方法結晶紫、初染，60秒碘液媒染60秒丙酮酒精數滴，脫色約60秒鹼性複紅液2～3滴，30秒鐘待幹，鏡檢。注：每一步均需細流水沖洗。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法結果觀察４.結果觀察油鏡觀察結果（1000×）放大倍數：10×100二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法結果觀察４.結果觀察白色念珠菌革蘭染色（1000×）放大倍數：10×100二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法意義５.革蘭氏染色意義（1）鑒別細菌（2）選擇抗菌藥物（3）研究細菌致病性

G+菌能產生外毒素，G-菌能產生內毒素，兩者的致病作用不同。二、細菌標本染色檢查法革蘭染色法注意事項６.注意事項（1）脫色過度，可使G+菌被誤染為G-菌；（2）脫色時間的長短還與塗片厚薄有關，以塗片薄而均勻為好；（3）多種因素如菌齡、染色時間、pH等影響結果。二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法１.原理：

分枝桿菌屬的細菌細胞壁脂質含量較高，特別是其中大量分枝菌酸可影響染料穿入。一旦著色後不易被鹽酸酒精脫色。二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.材料:（1）結核病人的痰液標本（2）抗酸染色液試劑盒（3）試管夾、玻片等。二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.方法

（1）塗片製備挑取痰液在玻片上涂成痰膜干燥固定二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.方法(２）染色方法初染：石炭酸复红染液(加染料然后加热至蒸汽冒出后放至一边继续染色至5min)，水洗。脱色：盐酸酒精脱至无色，水洗。复染：碱性美兰（1min)，水洗。二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.結果觀察:抗酸陽性菌為紅色抗酸陰性菌為藍色二、細菌標本染色檢查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.結果結果報告方式（直接塗片法）仔細觀察300視野(觀察時間不少於4min)，未發現抗酸桿菌。

士：可疑。發現抗酸菌l～2條／300視野。

+：發現抗酸菌3～9條／100視野。

++：發現抗酸菌1～9條／10視野。

+++：發現抗酸菌1～9條／每視野。

++++：發現抗酸菌≥10條／每視野。二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法1.原理

新型隱球菌的莢膜較厚，一般不易著色，同時菌體折光性較強，用墨汁負染色法可在黑色背景下看到透亮的菌體。二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法2.材料（1）菌種新型隱球菌（2）試劑優質墨汁（3）其他載玻片、蓋玻片、鑷子二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法2.材料（1）菌種新型隱球菌（2）試劑優質墨汁（3）其他載玻片、蓋玻片、鑷子二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法3.方法（1）滴一滴墨汁於載玻片,取菌並混勻。（2）蓋蓋玻片（覆蓋於菌液上，注意先將蓋玻片一邊接觸菌液緩緩斜放下，以免產生氣泡）。（3）先低倍鏡找好視野，再換高倍鏡／油鏡觀察。二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法4.結果觀察二、細菌標本染色檢查法墨汁負染色法（二）墨汁負染色法4.臨床意義新型隱球菌可引起全身各組織器官炎症，最易侵犯的是中樞神經系統，引起慢性腦膜炎。墨汁負染色法可鑒別新型隱球菌。三、細菌特殊結構的觀察三、細菌特殊結構的觀察細菌特殊染色法：鞭毛染色法芽胞染色法四、實驗報告書寫0102030506040708實驗題目實驗目的實驗原理實驗結果實驗方法實驗報告書寫03實驗材料結果分析實驗意義四、實驗報告要求實驗報告要求（一）實驗報告內容要求1.繪圖葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌的基本示意圖，記錄革蘭氏染色結果，分辨出革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。2.

如果染色結果不理想，請分析原因。四、實驗報告要求實驗報告要求（二）細菌形態示意圖繪圖要求1.選擇形態典型的部分細菌，紅蘭色筆繪圖。2.繪細菌的形態、排列，細菌的大小比例應適宜，輪廓上（如球菌、桿菌）應有所區分。注明菌名：大腸桿菌染色法：放大倍數：10×100一、細菌的人工培養一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識1.細菌人工培養的目的感染性疾病的病原學診斷

鑒定細菌，指導臨床用藥。細菌學研究

用於細菌生理、遺傳變異、致病性和耐藥性等研究。生物製品的製備

疫苗、抗毒素等的製備。一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識2.細菌人工培養的基本步驟制备培养基接种培养一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識3.細菌培養基的種類根據營養組成和用途可分為基礎、增菌、選擇、鑒別、厭氧根據物理狀態分為液體、固體、半固體鑒別培養基一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識3.細菌培養基的種類普通平板血平板半固體培養基液體培養基一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識4.培養基的製備调配成分溶解矫正pH过滤澄清分装灭菌质量检查和保存一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識5.細菌培養方法需氧培養法二氧化碳培養法厭氧培養法一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識5.細菌培養方法需氧培養法二氧化碳培養法厭氧培養法二氧化碳培養箱電熱恒溫培養箱一、細菌的人工培養基本知識（一）細菌人工培養的基本知識5.細菌培養方法燭缸二氧化碳培養法厭氧袋一、細菌的人工培養操作內容（二）細菌人工培養操作1.操作內容操作內容目的平板分區劃線分離細菌斜面純培養增菌及菌種保存半固體培養觀察動力和菌種保存一、細菌的人工培養實驗材料（二）細菌人工培養操作2.材料工具：接種環、接種針菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌培養基：普通平板培養基、斜面培養基、半固體培養基一、細菌的人工培養實驗材料（二）細菌人工培養操作2.材料斜面培養基(2-3%瓊脂)半固體培養基(0.2-0.5%瓊脂)普通平板培養基(2-3%瓊脂)一、細菌的人工培養操作流程（二）細菌人工培養操作3.操作流程领取菌种及培养基分别进行平板、斜面及半固体培养基接种，然后贴上标签。37度恒温箱培养18～24小时后观察结果。一、細菌的人工培養實驗方法及結果（二）細菌人工培養操作4.實驗方法及結果平板分區劃線法分區劃線結果一、細菌的人工培養實驗方法及結果（二）細菌人工培養操作4.實驗方法及結果斜面純培養一、細菌的人工培養實驗方法及結果（二）細菌人工培養操作4.實驗方法及結果半固體培養結果穿刺接種二、細菌的生化反應二、細菌的生化反應（一）生化反應基本原理基本原理不同的細菌含有不同的分解代謝的酶具有不同的分解代謝途徑對同一營養物質的分解代謝及其產物有所不同知識點

利用生化方法檢測代謝產物以判斷細菌的分解代謝特徵，從而達到鑒定細菌的目的。稱：細菌的生化反應檢測法二、細菌的生化反應常見的生化反應基本原理對糖的發酵甲基紅試驗單糖發酵試驗VP試驗對蛋白質的分解吲哚試驗硫化氫試驗枸櫞酸鹽利用試驗尿素酶試驗其他試驗二、細菌的生化反應（二）實驗材料實驗材料1.菌種大腸埃希菌、沙門氏菌2.微量生化反應管葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、蛋白腖水（靛基質）、硫化氫。3.試劑吲哚試劑二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容糖發酵試驗糖發酵試驗（1）原理大腸埃希菌：分解乳糖產酸產氣致病性腸道細菌：大多數不分解乳糖CO2↑+H2↑糖\醇類細菌產生的酶酸（HCOOH)脫氫酶（培養基含葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇或蔗糖等一種糖類，並加酸堿指示劑，如溴甲酚紫）二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容糖發酵試驗糖發酵試驗（2）方法大腸埃希菌、沙門氏菌37℃培養18～24h接種針穿刺接種5種糖生化反應管觀察結果二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容糖發酵試驗糖發酵試驗（3）結果判斷——觀察培養基顏色變化與氣體產生情況溴甲酚紫紫色黃色中性或碱性酸性對照+-+有細菌生長培養基呈混濁，可能出現3種結果。二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容靛基質（吲哚）試驗2.靛基質（吲哚）試驗（1）原理玫瑰吲哚（紅色）色氨酸色氨酸酶吲哚（無色）吲哚試劑培養基中加入色氨酸二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容靛基質（吲哚）試驗2.靛基質（吲哚）試驗（2）結果判斷——觀察培養基與吲哚試劑交界處顏色變化陽性陰性(+）

（-)二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容

硫化氫試驗3.硫化氫試驗（1）原理硫化鐵或硫化鉛（黑褐色）含硫氨基酸酶硫化氫（無色）+鐵離子或+鉛離子培養基中加入含硫氨基酸、鉛離子、鐵離子二、細菌的生化反應（三）實驗操作內容

硫化氫試驗3.硫化氫試驗（2）結果判斷分組與材料分配分組與材料分配分組兩人一組操作內容細菌的人工培養細菌的生化反應菌種金葡菌、大腸桿菌各一支沙門氏菌、大腸桿菌各一支培養基1塊普通平板/人7種生化反應管/人1支斜面培養基/人1支半固體培養基/人一、病例的分析方法一、病例的分析方法病例分析病例主訴：持續發熱、腹瀉3天。病史：一周前外出旅遊，回來後食欲不振，開始發熱，第一次量體溫是38℃，而後多次量體溫都是39.5℃。發熱的同時有腹漲、腹瀉，大便剛開始成形，後成水樣，一天四到五次。曾服用氟呱酸，無效。查體：患者表情淡漠，體溫39℃，脈搏50次/分，腹部觸疹肝脾腫大，其他無異常。二、腸桿菌科細菌鑒定程式二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式（二）腸桿菌科細菌鑒定程式血液標本糞便標本分離培養SS/EMB生化試驗血清學試驗藥敏試驗增菌培養純培養KIA二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式（一）腸桿菌科細菌分離鑒定常用培養基分離培養——選擇性培養基SS:分解乳糖——菌落呈粉紅色不分解乳糖——菌落呈無色半透明SSEMB二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒別培養基傷寒沙門菌SS大腸桿菌SSSS:分解乳糖——菌落呈粉紅色不分解乳糖——菌落呈無色半透明福氏志賀菌SS二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒別培養基EMB:分解乳糖——菌落呈深紫色並有金屬光澤不分解乳糖——菌落呈無色或淡黃色半透明大腸桿菌EMB平板二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式（一）腸桿菌科細菌分離鑒定常用培養基2.純培養——KIA培養基下層觀察顏色、產氣：變黃——分解葡萄糖產酸變黃且培養基斷裂——產酸產氣2.觀察黑色沉澱——產生硫化氫上層觀察顏色：變黃——分解乳糖產酸變紅——不分解乳糖二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式KIA培養基結果可作出初步鑒定葡萄糖乳糖硫化氫大腸埃希菌＋＋－沙門菌屬＋－＋志賀菌屬＋－－二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式陰性對照銅綠假單胞菌宋內志賀菌傷寒沙門菌大腸桿菌變形桿菌二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式3.腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式生化編碼鑒定管基本原理氨基酸脫羧酶試驗賴氨酸鳥氨酸氨基酸脫羧酶培養基pH↑屍胺腐胺+CO2

為防止出現假陽性結果，必須同時接種氨基酸對照管，並且接種後在氨基酸管內滴加液體石蠟。結果：指示劑為溴甲酚紫，鹼性呈紫色為陽性酸性呈黃色為陰性注意：對照管應為陰性，否則實驗失敗二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式生化編碼鑒定管基本原理②苯丙氨酸脫氨試驗苯丙氨酸苯丙氨酸脫氨酶深綠色反應苯丙酮酸結果：綠色——陽性不變色——陰性+FeCl3二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式生化編碼鑒定管基本原理③脲酶試驗（尿素分解試驗）尿素尿素酶碳酸銨培養基pH↑結果：指示劑為酚紅粉紅色——陽性不變色——陰性陽性陰性對照2NH3+CO2+H2O2NH4OH+CO2二、腸桿菌科細菌鑒定程式鑒定程式生化編碼鑒定管基本原理④枸櫞酸鹽利用試驗

——培養基中只有枸櫞酸鹽一種碳源，細菌能利用枸櫞酸鹽則可以生長，並分解氨基酸。枸櫞酸鹽氮源（氨基酸）培養基pH↑溴麝香草酚藍指示劑變藍色結果：藍色——陽性不變色——陰性對照+-三、細菌的血清學試驗三、細菌的血清學試驗血清學試驗鑒定菌種血清学鉴定血清学诊断診斷疾病玻片凝集反應試管凝集反應三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理（一）實驗原理根據抗原抗體反應具有高度特異性的特點，用已知抗體來檢測未知抗原（細菌）；或用已知的抗原（細菌抗原）來檢測血清中未知抗體的效價（肥達反應），從而輔助診斷疾病。三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理細菌的血清學試驗——沙門氏菌為例沙門氏菌的主要抗原組成O抗原：至少58種,含相同抗原組分歸為一組，引起人類疾病的沙門菌大多數在A~F組。H抗原：分為Ⅰ、Ⅱ相，Ⅰ相以a、b、c等表示，Ⅱ相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不穩定，可阻止O抗原與其相應抗體的凝集反應。三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理1.血清學診斷——肥達反應5050505050505050501:401:801:1601:3201:64050棄掉1234550650NS(μl

)待測血清對照管①②③④滅活的傷寒菌液（已知抗原）50μl

50μl

50μl

50μl

50μl

50μl

待測血清稀釋度徹底混勻52℃,1h100100100100100三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理細菌的血清學試驗——肥達反應結果判斷與分析（1）

觀察凝集程度上清沉澱凝集程度清亮大的凝集塊++++輕度混濁大多凝集管底+++中等混濁小、部分凝集塊++混濁很小的凝集顆粒+與對照相同無凝集現象-三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理細菌的血清學試驗——肥達反應結果判斷與分析（2）判定效價（滴度）：產生明顯凝集反應（++）的最高血清稀釋度為血清中所測抗體的效價。效價愈高，表示血清中所含該抗體愈多。如血清的最低稀釋度仍無凝集，或血清效價低於1：80，則為陰性，應報“<1：80”；如果血清的最高稀釋度1：1280仍呈“++”或更強凝集，則血清效價應報“>1：1280”。三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理細菌的血清學試驗——肥達反應結果判斷與分析（3）

人體血清中H與O抗體的性質及其消長意義抗體類型體內出現特徵體內出現情況O抗體IgM出現較早，維持時間短高高低H抗體IgG出現較晚，維持時間長高低高患腸熱症可能性大感染早期、其他沙門菌引起的交叉反應預防接種；非特異性回憶反應三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理思考題1.李某發熱、全身不適，體溫持續升高，最高達40℃，采血進行肥達氏實驗檢測，檢測結果是O抗體凝集效價是1:80，H抗體凝集效價是1:320。請根據肥達氏試驗檢測結果分析李某的感染情況。三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理沙門氏菌屬國內常見菌型診斷抗原表群別菌型抗原OHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C

豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,22.細菌的血清學鑒定——玻片凝集反應三、細菌的血清學試驗血清學試驗原理沙門氏菌診斷血清（11種已知抗體）O2O4O7O9HaHbHcHdHiViA-F群多價OA-F群多價O三、細菌的血清學試驗血清學試驗（4）結果分析群別菌型抗原oHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,2四、實驗操作內容四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定（一）腸桿菌科細菌鑒定1.材料菌種1號菌、2號菌培養基SS平板、EMB平板、KIA培養基、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管試劑液體石蠟、吲哚試劑、FeCl3四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定2.分組與材料分配（1）2人/組（2）1種待檢菌/人（3）SS、EMB各1個/人（4）1支KIA/人（5）生化編碼管1套/人四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定3.方法（1）將待檢細菌分別接種相應培養基平板分區劃線KIA先穿刺接種底層再在斜面劃線接種

微量管直接穿刺接種（2）7℃培養18~24小時（3）觀察結果四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定4.微量管使用方法（1）按順序排列（2）標籤、液面在膠布外（3）在所有微量管中接種細菌四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定糖、醇+黃色硫化氫+黑色-紫色-不變色黃色，氣泡吲哚+粉紅色賴氨酸鳥氨酸+紫色-不變色-黃色枸櫞酸鹽+藍色苯丙氨酸+綠色-淺綠色-不變色尿素酶+粉紅色-不變色+各項生化編碼鑒定管結果判斷四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定5.結果判斷記錄各項試驗結果填入腸桿菌科11E編碼鑒定結果記錄表計算總值查詢腸桿菌科11E編碼鑒定手冊得出菌種名稱。如果有必要應做補充試驗。四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定腸桿菌科生化編碼鑒定管結果記錄方法AG++++-----470AG470大腸埃希菌+四、實驗操作內容腸桿菌科細菌鑒定腸桿菌科生化編碼鑒定管結果記錄方法A+-++-++--730沙門菌屬A730+四、實驗操作內容血清學試驗（二）血清學試驗——血清學鑒定血清學鑒定材料分配分組4人/組菌種待測菌種一支診斷血清1盒/組四、實驗操作內容血清學試驗血清學鑒定流程A-F群多价及ViA-F群多价-Vi-非沙门氏菌，无需继续鉴定A-F群多价+Vi-初步判断为沙门氏菌属继续鉴定O抗原、H抗原成分。A-F群多价-Vi+初步判断为沙门氏菌属去除菌体Vi荚膜继续鉴定其他抗原成分。病例分析的書寫要求病因，病史、主要病症體格檢查輔助檢查分析結論病例1王某某，女，51歲，農民主訴：右手指割傷5天，發熱、頭疼2天病史：患者於5天前手指被鐮刀割傷，除稍加包紮外未作任何處置。包紮傷口因洗菜等多次被水弄濕，次日手指腫痛，開始服用去痛片及磺胺等，近兩天自覺發熱、頭疼、全身不適而求醫。體檢：右手食指傷口紅腫，有少許粘稠黃白色分泌物，右液窩淋巴結可觸及，餘均正常。體溫37.8℃，白細胞總數12000/mm3，中性粒細胞80%。病例分析中年女性2.右手指割傷5天，手指腫痛4天，發熱、頭疼2天。查體：T37.8℃；右手指紅腫，有黃色膿液；右腋窩淋巴結腫大。輔助檢查：白細胞總數12000/mm3，中性粒細胞80%。右手指割傷後化膿性炎症

需氧菌：葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌等厭氧菌：產氣莢膜梭菌、無芽胞厭氧菌等創傷感染化膿菌病例2任某某，男，21歲，醫學院學生主訴：持續發熱5天，伴全身不適。病史：患者於2周前到校外的小食店進食涼菜，於5天前無明顯誘因出現發冷發燒，全身不適，多汗，食欲不振等。體檢：患者呈急性面容、潮紅、神清但略有呆滯，前胸見散在的細小紅色丘疹。體溫39.4℃，脈緩52次/min，心、肺無陽性體症，睥可觸及，白細胞3600/mm3，中性粒細胞60%。

病例分析青年男性進食涼菜後發熱，伴全身不適5天。查體：體溫39.4℃，脈緩52次/min；表情淡漠；前胸皮膚玫瑰疹；脾大。輔助檢查：白細胞3600/mm3，中性粒細胞60%。疑似沙門菌感染所導致的腸熱症

病例3

患者黃××，男，65歲，因外傷手術後持續發熱，腹痛，於2007年3月31日再次會診。患者於一周前因車禍，造成腹部外傷，腸穿孔，緊急送醫院作腸吻合術，輸入青黴素。患者術後體溫仍高達39℃，腹部有明顯壓痛，危重病容。遂由內、外科醫師大會診。經化驗檢查，白細胞總數5000/mm3，中性粒細胞90%，淋巴細胞10%，血培養有革蘭氏陰性桿菌生長。病例分析老年男性腹部外傷手術後持續發熱，腹痛一周。查體：體溫39℃；危重病容；腹部明顯壓痛。輔助檢查：白細胞5000/mm3，中性粒細胞90%，淋巴細胞10%，血培養有革蘭氏陰性桿菌生長。疑似腸道細菌引起的腸道外感染病例4患者：男，27歲。主訴：左下頜腫痛伴發熱5天。現病史：7天前患者左下後牙出現持續性鈍痛，逐漸加重，後發展為劇烈跳痛；5天前左下頜突然腫脹，疼痛更加劇烈，並向同側耳顳部放射。經當地衛生院連續4天抗菌治療（靜脈滴注青黴素），未見好轉，局部疼痛和腫脹更加明顯，並有吞咽痛及開口輕度受限。患者體溫升高，食欲減退，精神疲憊。既往史：左下後牙反復疼痛史1年；每次發作時，均可經抗生素治療後好轉。體檢：患者急性痛苦面容，體溫38.6度，左頜面部腫脹，下頜骨下緣輪廓消失，皮膚緊張，壓痛，皮溫增高，膚色發紅，有波動感。開口度3cm。齦及前庭溝黏膜充血水腫，齦袋內有膿液。口底黏膜充血水腫，舌運動輕度受限。實驗室檢查：白細胞15000/mm3，中性粒細胞90％。病例分