PACAP葡萄糖依赖性促进大鼠胰岛素分泌及机制研究

PACAP葡萄糖依赖性促进大鼠胰岛素分泌及机制研究目的:研究垂体腺苷酸环化酶激活肽（PituitaryAdenylateCyclase-ActivatingPolypeptide,PACAP）对大鼠胰岛胰岛素分泌的影响及其在胰岛β细胞中的作用机制,为进一步探讨胰岛素分泌的调控机制,寻找治疗糖尿病的潜在靶点提供实验依据。方法:采用正常雄性Wistar大鼠胰岛及胰岛β细胞为研究对象。大鼠急性处死后,将胶原酶P经胆总管注入胰腺内消化11分钟,培养液终止消化,Histopaque1077梯度离心得到散在的大鼠胰岛颗粒,再经DispaseⅡ消化胰岛为单个胰岛细胞。（1）胰岛素分泌实验探究在不同环境下PACAP对大鼠胰岛胰岛素分泌的影响。（2）膜片钳技术探讨PACAP与单个胰岛β细胞动作电位的关系。全细胞电压钳模式下研究在不同条件下PACAP与单个胰岛β细胞电压依赖性钾（Kv）通道电流及电压依赖性Ca2+（VDCC）通道电流的关系。（3）利用钙成像技术监测在不同干预下胰岛β细胞内Ca2+浓度变化。结果:（1）PACAP在2.8mmol/L葡萄糖作用下对大鼠胰岛胰岛素分泌无影响,但在高糖作用下（8.3mmol/L）存在浓度依赖性地促进胰岛素分泌,且促胰岛素分泌作用随着葡萄糖浓度的升高而增强。（2）PACAP能够延长动作电位时程,减小电压依赖性钾（Kv）通道电流。（3）PACAP促胰岛素分泌作用不仅与Kv通道有关,还与电压依赖性钙（VDCC）通道有关。通过全细胞电压钳技术记录发现PACAP可增加电压依赖性Ca2+通道电流。（4）钙成像技术表明PACAP升高细胞内Ca2+浓度,且该作用与电压依赖性Ca2+通道有关。（5）应用不同受体阻断剂发现PACAP促胰岛素分泌主要作用于PAC₁受体,而并非VPAC₁和VPAC2受体。（6）PAC₁受体阻断剂PACAP（6-38）能够逆转PACAP减弱Kv通道电流的作用。（7）分别使用特异性腺苷酸环化酶（Adenylylcyclase,AC）抑制剂SQ22536和蛋白激酶A（ProteinKinaseA,PKA）抑制剂H89发现SQ22536或H89均能显著地减弱PACAP促大鼠胰岛胰岛素分泌作用和PACAP对电压依赖性钾通道的抑制作用。（8）PACAP（6-38）可削弱PACAP增强电压依赖性Ca2+通道电流及细胞内的Ca2+浓度作用。结论:高糖情况下PACAP能呈剂量依赖性促进大鼠胰岛胰岛素分泌,但在低糖情况下不影响胰岛素分泌,因此PACAP在发挥促胰岛素分泌作用时不易诱发低血糖风险,PACAP促进胰岛素分泌具有葡萄糖浓度依赖的特性。在大鼠胰岛β细胞中PACAP促进胰岛素分泌主要的机制是PACAP通过作用于PAC₁受体,激活AC及其下游效应器PKA,抑制Kv通道,使β细胞动作电位时程延长,增加电压依赖性Ca2+通道开放时间,最终导致细胞内Ca2+浓度升高。PACAP也可通过结合PAC₁受体,增强电压依赖性Ca2+通道电流,使细胞内Ca2+浓度升高,进而促进胰岛素分泌。本课题为PACAP促大鼠胰岛素分泌机制提供了新观点。此外,我们的研究表明PAC₁