山慈菇多糖的提取及其对荷瘤小鼠(H22)体内和体外的作用机制的初步研究

山慈菇多糖的提取及其对荷瘤小鼠（H22）体内和体外的作用机制的初步研究恶性腹水是晚期或复发恶性肿瘤的一种非常严重和棘手的并发症,而临床上对其治疗,多为穿刺或者静脉分流术,但是这些治疗方法并不能解决根本问题。山慈菇,一种兰科植物的假鳞茎,在中医治疗中常常与其它药物配伍使用,广泛应用于抗炎和抗肿瘤,但其治疗恶性腹水的效果尚不清楚。目的:(1)从山慈菇中提取山慈菇多糖,并对其进行浓度测定,单糖组成,二级结构以及相对分子质量的测定。(2)建立小鼠H22肝癌细胞腹水模型,探究山慈菇多糖在小鼠体内对于恶性腹水的作用以及对其免疫机制的研究。(3)在体外用山慈菇多糖直接作用于H22肝癌细胞,并对其抗肿瘤作用的机制进行初步探究。方法:(1)利用水提醇沉法提取山慈菇多糖,用三氯乙酸除去蛋白,有机试剂洗涤,透析等方法纯化多糖。采用苯酚-硫酸法测得提取多糖的浓度,用电感耦合等离子体质谱进行单糖分析,用凝胶渗透色谱法分析多糖的相对分子质量,并用气相色谱对该多糖的二级结构进行预测。(2)用H22肝癌细胞在Balb/c小鼠体内建立腹水模型,将不同浓度的山慈菇多糖用腹腔注射法隔天给药给予治疗,并采用同样的方法用环磷酰胺做阳性对照,生理盐水做阴性对照,七次治疗后观察小鼠的腹围,体重和生存期。在第18天后随机处死一半小鼠,提取脾淋巴细胞,采用淋巴细胞转化实验测定T和B淋巴细胞的增殖指数;采用E-rose实验检测T细胞的免疫功能状态;并用特异性抗体标记CD8+和NK细胞,用流式细胞仪分析各组治疗后CD8+和NK细胞的比例;分选小鼠脾淋巴细胞的CD4+CD25+,提取其mRNA,在mRNA水平上检测Foxp3基因的表达。用免疫组化法在小鼠的腹水细胞中分析Foxp3和Stat3的表达。用ELISA法测定小鼠血清和腹水中相关免疫因子的变化。并且用ELISA法测量小鼠血清内的甘露糖和葡萄糖的浓度水平。(3)在体外,用CCK8(CellCountingKit-8)法测山慈菇多糖对H22小鼠肝癌细胞及鼠的正常肝上皮细胞BRL-3A细胞的增殖抑制率;并用同样的方法排除甘露糖和葡萄糖对H22细胞的影响;采用Hoechest33258和Tunel法检测H22细胞凋亡情况,并用Western-blot法,ELISA法检测相关蛋白表达情况,探究山慈菇多糖体外抑制H22细胞的潜在机制。结果:经过提取和纯化的山慈菇多糖,测得其最后的浓度为30mg/mL,对其进行分析,发现山慈菇多糖里含有60%的甘露糖,37%的葡萄糖,还有少量的半乳糖,岩藻糖,木糖,鼠李糖。其重均相对分子质量为383.569kDa。山慈菇多糖的二级结构在180-260nm处,主要是反平行和无规卷曲,然后是β-转角和平行螺旋。(2)在小鼠移植瘤H22恶性腹水模型中,我们发现与对照组相比,山慈菇多糖治疗组的小鼠的腹围和体重明显减少,而生存率和存活时间明显增加了。提取小鼠的脾淋巴细胞,在脾淋巴细胞增殖的实验和E花环实验中,结果发现小鼠脾淋巴细胞的刺激指数和花环形成率随山慈菇多糖浓度的增加而增长。除此之外,山慈菇多糖提高了小鼠脾淋巴细胞内的CD8+T淋巴细胞和NK细胞的比例。同时,山慈菇多糖治疗组小鼠的脾淋巴细胞比对照组小鼠的Foxp3表达减少。利用免疫细胞化学技术,山慈菇多糖组的小鼠腹水淋巴细胞对比对照组,Foxp3和Stat3表达随着山慈菇浓度的升高而减少。而且,山慈菇多糖小鼠血清内的细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ随着浓度的增加而分泌增多,VEGF则分泌减少。而山慈菇多糖治疗组小鼠血清内的甘露糖和葡萄糖的含量远远小于对照组。(3)体外结果显示,山慈菇多糖对H22肿瘤细胞有一定的抑制作用,并表现出时间和浓度依赖性,48h多糖浓度为4mg/mL时的抑制率达到50%。同时,山慈菇多糖在同等浓度下,对小鼠正常肝上皮细胞BRL-3A无影响。而且在甘露糖和葡萄糖的排除实验中,发现甘露糖和葡萄糖的混合糖溶液在24小时的低浓度下,对H22细胞有很小的促进作用,但在高浓度(4mg/mL)下,在48小时后,该混合糖溶液对H22细胞有抑制作用,但最大抑制率不超过16%,比山慈菇多糖对H22细胞的影响要小得多。经Hoechest33258染色实验和Tunel染色检测细胞凋亡及其半定量分析,结果发现,山慈菇多糖能够诱导H22细胞凋亡,且其凋亡程度呈现出时间及浓度的依赖关系;ELISA法检测细胞凋亡蛋白结果表示山慈菇多糖显著诱导了H22细胞的Caspase-3和Caspas-8激活;Western-blot结果显示:山慈菇多糖治疗组比对照组的Jak1、Stat3和Bcl-2蛋白质表达水平显著减少,而Bax的表达增加。定量分析表明,山慈菇多糖显著抑制了Jak1-Stat3途径,并提高了Bax/Bcl-2的比例。结论:1、山慈菇多糖是一个不均一性多糖,它的主要成分为甘露糖和葡萄糖,还有少量的其它益生糖,其相对分子质量为383.569kDa,二级结构主要是在180-260nm的反平行和无规卷曲,然后是β-转角和平行螺旋。2、山慈菇多糖可以显著的减少和延缓小鼠恶性腹水的生成,显著延长恶性腹水小鼠的生命。3、山慈菇多糖能够刺激T细胞和B细胞的生长,增加CD8+和NK淋巴细胞的比例,促进分泌IL-2,IFN-γ和TNF-α,减少VEGF的表达。此外,PRP可以减少小鼠体内的Foxp3和Stat3的表达。山慈菇多糖在体内可以通过提高荷瘤小鼠的机体免疫力达到抗肿瘤的作用。4、山慈菇