(全国百强校)江西新余第第一中学学苏版高中生物一资料：微生物的实验室培养

课题1微生物的实验室培养专题2微生物的培养与应用（一）培养基

1、定义：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2、培养基成分:碳源、氮源、水和无机盐等4类★另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。如:培养乳酸菌时需添加维生素、霉菌PH调成酸性、细菌PH调成中性或微碱性、厌氧微生物提供无菌条件。★4类成分齐全的培养基叫基本培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基

3、培养基的种类和用途液体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基鉴别培养基据用途分①常用于工业生产②实验室对菌种的选择和扩大培养形成菌落，用于微生物的分离、鉴定、计数常用于工业生产常用于分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。半固体培养基：液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基：菌落单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落特征是鉴定菌种的重要依据。半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

选择培养基:从微生物群中选择具有特定表型的细胞.使之进行繁殖所用的培养基,称为选择培养基.

加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌

不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加尿素为唯一氮源的培养基分离能合成脲酶，分解尿素的细菌加纤维素为唯一碳源的培养基分离能分解纤维素的微生物例如，在培养基中加伊红和美蓝，用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈黑色在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养分解尿素的细菌，尿素-氨，PH升高，指示剂变红色在以纤维素为唯一碳源的培养基加刚果红，产纤维素酶的菌落周围会出现透明圈鉴别培养基:在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。

大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

（二）无菌技术1.成功地培养微生物的关键：无菌技术包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌（干热灭菌、高压蒸汽灭菌）；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；（无菌操作）

（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。防止外来杂菌的入侵无菌技术目的具体方法消毒使用较为温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物营养体的过程（不包括芽孢-休眠体和孢子-繁殖体）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法100℃煮沸5-6min70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高温的液体）用75%酒精皮肤消毒;氯气消毒水源、消毒水灭菌用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括。包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程灼烧灭菌干热灭菌高压蒸气灭菌熏蒸灭菌细菌过滤器灭菌接种环、接种针、试管口金属工具、玻璃器皿等160-170℃下加热1-2h100kPa、121℃下维持15-30min灭菌与消毒技术是微生物工作中最普通也是最重要的技术1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考（三）.基本操作程序：培养基配制、接种、菌种保藏1、培养基的配制计算→称量→溶化→调pH→分装→灭菌→倒平板→无菌检查溶化后分装前锥形瓶或试管中培养基高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，倒置①使培养基表面的水分更好地挥发，②防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术（三）.基本操作程序2、微生物接种的方法平板划线法：通过接种环（操作的第一步及每次划线前、划线结束时都要灼烧接种环、冷却）在琼脂固体培养基表面连续划线（每次划线都从上一次划线的末端开始，最后区域的划线不要与第一区域相连）将聚集的菌种逐步稀释分散，数次划线后可获得由一个细胞繁殖而来的单个菌落，不能用于计数平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数稀释涂布平板法：将菌液进行梯度稀释，不同稀释度的菌液分别用涂布器涂布到固体培养基表面，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，能培养成单个菌落，常用于计数，一般选择菌落数在30-300的平板进行技术，统计的菌落数往往比活菌数低：当两个或多个菌连在一起时，观察到的是一个菌落（三）.基本操作程序2、微生物接种的方法平板划线法：通过接种环（操作的第一步及每次划线前、划线结束时都要灼烧接种环、冷却）在琼脂固体培养基表面连续划线（每次划线都从上一次划线的末端开始，最后区域的划线不要与第一区域相连）将聚集的菌种逐步稀释分散，数次划线后可获得由一个细胞繁殖而来的单个菌落，不能用于计数平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数稀释涂布平板法：将菌液进行梯度稀释，不同稀释度的菌液分别用涂布器涂布到固体培养基表面，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，能培养成单个菌落，常用于计数，一般选择菌落数在30-300的平板进行技术，统计的菌落数往往比活菌数低：当两个或多个菌连在一起时，观察到的是一个菌落注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

④涂布平板法所选择的稀释度很重要3、菌种的保存（1）、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。（2）、甘油管藏法四、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）分离纯化大肠杆菌，练习平板划线法总结微生物培养的基本程序一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照㈠.筛选菌株1、自然界中：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2、实验室中微生物的筛选原理（方法）：（1）提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)（2）抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基3、可以用液体培养基：选择培养（扩大培养）增菌后，稀释涂布到固体培养基：分离、纯化---计数、鉴定1.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法㈡.统计菌落数目：2、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以观察；需要相对高的细菌浓度；缺点设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：㈣.样品稀释◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数（如果三个数据差异不大）；◆如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，不能用于计算平均值，因为它不接近真实值，应重新实验并注意：将菌液摇匀后再接种P22㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。同种微生物表现出稳定的菌落特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等微生物的培养与观察二.实验的具体操作

㈠.制备培养基：㈡.土壤取样[三]也可以有选择培养这一步[三]样品的稀释制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、得到适于计数的平板通过选择培养：选择出并扩大培养）4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌10-5㈢.设置对照：设置对照的方法：A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是A同学的由于培养基污染三是操作失误，培养基混入其它氮源方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如结果与A同学一致，则证明A无误；否则，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案三：培养基混入其它氮源：重新配制培养基，除了不加尿素，其他物质与尿素培养基完全相同，接种菌种，培养观察是否有菌落出现，有→则培养基混入其它氮源四.课外延伸对分离的菌种做进一步鉴定，还需借助生物化学的方法

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。（选择并鉴定）原理：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基碱性增强，PH升高。分离原理：（一）纤维素与纤维素酶纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。地球上含量最丰富的多糖。纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。纤维素C1酶Cx酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖课题3分解纤维素的微生物的分离刚果红（CR）染色法

刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选与鉴定

用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚果红染成红色的纤维素分解了。一、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释

将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上

筛选产生透明圈的菌落①要在富含纤维素或落叶较多的环境中寻找纤维素分解菌②将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集①通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖，②液体培养基，因为没有添加琼脂。P29①刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应②如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌P29二、结果分析与评价1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。1．纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。2．为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。3．流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。三、课题延伸（2）灭菌的定义：是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括。包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程。

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别使用较为温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物营养体的过程（不包括芽孢-休眠体和孢子-繁殖体）（１）消毒定义：

用75%酒精皮肤消毒;氯气消毒水源、消毒水(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高温的液体）3、化学药剂消毒法:1、灼烧灭菌接种环、接种针、试管口(2)灭菌的方法：2、干热灭菌：金属工具、玻璃器皿等160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min4、紫外线灭菌-30分钟，杀死物体表面或空气中的微生物……5、熏蒸灭菌6、细菌过滤器灭菌3.微生物实验室培养的基本操作程序培养基的配制接种纯化大肠杆菌菌种的保藏计算称量溶化调pH分装灭菌倒平板无菌检查按配方比例计算称量纸、吸潮、迅速、盖盖称量纸一起放、搅拌防止琼脂糊底、补水至100ml溶化后分装前培养基高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，