12种中草药水煎剂抗刚地弓形虫感染的初步研究

12种中草药水煎剂抗刚地弓形虫感染的初步研究刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种重要的人兽共患性寄生虫,对人类健康、公共卫生安全和畜牧业生产均危害严重。目前,尚无理想疫苗和治疗性药物。中草药在我国使用年份久远,种类丰富,所含成分极其复杂,可作为研发抗弓形虫感染特效药的重要突破口。因此,本文依照弓形虫疾病常见临床症状,有针对性地选择苍术等12种中草药作为实验对象,经分别制备水煎剂,旨在探究其抗刚地弓形虫感染效果,建立中草药抗弓形虫感染通用研究方法的同时,也为日后研制弓形虫特效治疗药物和深入解析中草药单体抑制弓形虫胞内增殖分子机制奠定基础。首先,本文以我国传统中药炮制方法为基础,分别制备了12种中草药水煎剂,经检测吸光度和干重发现,所得水煎剂均含有不同程度的色素,并且干重与吸光度间无明显相关关系,相同干重的中草药水煎剂吸光度差别很大。其次,本文选择刚地弓形虫ACT1序列为靶基因,合成5对特异性较强的引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,优化了PCR反应条件,建立了适用性更强、应用范围更广的Real-timePCR弓形虫定量分析系统,并且所得水煎剂对已建系统无干扰。细胞毒性检测结果显示,水煎剂种类不同,细胞毒性差异较大,当经64倍稀释后均毒性不明显,表明探究所得水煎剂抗弓形虫感染效果前需要(I)明确所选中草药有抑制刚地弓形虫体外增殖作用和(II)统一水煎剂作用浓度。鉴于本文所得水煎剂体外抗弓形虫感染效果评价主要是在24孔细胞培养板内完成的,因此我们以9种常见回归模型对24孔板内弓形虫速殖子数进行曲线拟合,经求解极值,获得单孔弓形虫感染量为1542.21个。预实验结果显示,槟榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡等5种水煎剂经64倍稀释后体外抗弓形虫感染效果显著(P<0.05),表明所选中草药有抑制弓形虫速殖子增殖能力。将水煎剂最终作用浓度统一定为64.0mg/mL后发现,槟榔、白薇、青蒿、佩兰和柴胡等5种水煎剂细胞毒性明显,其余7种水煎剂及其组合对体外弓形虫增殖较空白对照均极显著抑制(P<0.001),且蒲公英可单向增强苍术抗感染效果,苍术与金银花存在药物协同作用关系。探究水煎剂不同组合比对弓形虫感染影响时发现,苍术-蒲公英以1:2组合时体外抗感染效果较等比例组合降低(P<0.05),即过量蒲公英对苍术-蒲公英联合抗感染药效有减弱作用。此外,苍术-金银花以2:1组合时体外抗感染作用较等比例组合时明显降低(P<0.05),即过量苍术可显著减弱金银花体外抗弓形虫感染能力。半数有效浓度检测结果显示,紫草、川乌和蒲公英抗弓形虫RH株、PRU株、VEG株和C7非典型株感染均作用明显,其中C7虫株最敏感。运用水煎剂对弓形虫感染进行预防时发现,所选水煎剂对实验鼠体重及脾内CD19~+B淋巴细胞含量均无统计学影响(P>0.05),佩兰和白芍可分别增多小鼠脾内CD3e~+CD4~+T和CD3e~+CD8a~+T淋巴细胞,苍术、独活和金银花对CD3e~+CD4~+T和CD3e~+CD8a~+T淋巴细胞均作用显著(P<0.05)。此外,佩兰、白芍和金银花对实验鼠脾淋巴细胞增殖有促进作用,其中以白芍作用最明显(P<0.01)。攻虫感染实验结果显示,12种水煎剂均不适合以灌胃形式预防弓形虫RH株急性感染,苍术、槟榔、佩兰、蒲公英和紫草、柴胡可分别用来预防PRU株脑包囊引发的急性和慢性感染过程。运用水煎剂对弓形虫感染进行治疗时发现,槟榔和蒲公英可分别减轻弓形虫RH株和PRU株感染鼠体重,所得水煎剂对弓形虫RH株和PRU株急性感染均疗效不明显(P>0.05)。值得注意的是,槟榔、紫草和白芍适合用来治疗由弓形虫PRU株引发的慢性感染过程,而苍术和青蒿有助于PRU株脑包囊感染鼠急性病程向慢性感染转变。本研究所选12种中草药对刚地弓形虫体内外抗感染效果均不相同,即使同种水煎剂在弓形虫急性和慢性感染过