小鼠肝核苷酸池、核酸池的特征及其与纤维化的作用关系

小鼠肝核苷酸池、核酸池的特征及其与纤维化的作用关系肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理基础,是进一步向肝硬化发展的中心环节,有关肝纤维化机理方面的研究无论是在细胞水平上还是在大分子水平上都已经相当深入,但是在对于细胞代谢和生命活动有着重要影响的小分子及其与大分子作用关系方面的关注甚少,尤其是对于核苷酸池的性质、动力学特征以及它与基因表达和纤维化进程的关系的研究尚属空白。本研究探索了纤维化过程中核苷酸池的性质、特点和动力学特征及其与病理过程和差异表达基因间的关系,同时也为纤维化及外源核苷酸缓解纤维化进程的作用机理提供了新的认识。采用CCl4诱导的方法建立肝纤维化小鼠模型,肝纤维化进程的衡量指标为AST、ALT酶活性和肝组织切片观测。采用HPLC法系统地测定了纤维化过程中CCl4诱导的小鼠和正常小鼠细胞内的核苷酸含量。有关CCl4诱导的纤维化小鼠的核酸池(代表性差异表达基因)数据是从Ensemb1、BioGPS数据库和文献中收集整理的。采用荧光定量PCR技术测定了核苷酸三个代谢途径的关键酶基因和7个小鼠肝纤维化相关基因的表达水平。一磷酸核苷酸(NMP)的含量,AST/ALT的比值以及代表性差异表达基因数据用来分析核苷酸池、核酸池和纤维化进程三者之间的相关性。酶活测定结果显示处理组小鼠的AST、ALT酶活性持续下降,但都显著高于对照组。从第8周开始,AST/ALT比值均大于1,指示肝损伤严重。组织切片观察发现从第4周开始,处理组有不同程度的肝纤维组织增生,纤维间隔形成,部分见假小叶形成,至第8周时,纤维化症状明显,而对照组却无明显变化。HPLC测定的结果显示处理组小鼠肝脏内的核苷酸池的表现特征与对照组的存在显著差别。处理组的核苷酸总含量和NMP含量在肝损伤早期显著低于对照组,而在纤维化期显著高于对照组。换言之,处理组小鼠中的核苷酸总含量和NMP的含量在持续增加,而对照组小鼠中的保持相对恒定。核苷酸池内核苷酸含量大小关系为NMP>>NDP>NTP。实验中共测定了8种核苷酸：处理组的AMP含量呈上升趋势,在第2周时显著低于对照组(p<0.05),从第6周开始高于对照组,到第10周时达到显著水平(p<0.01)；处理组的ADP含量在第2周时显著低于对照组(p<0.01)在第4周时开始上升,到第10周时显著高于对照组(p<0.01)；ATP含量在处理组与对照组中没有显著性差异。处理组的GMP含量保持上升趋势,在第2、4、8周与对照组无显著性差异,在第6周和第10周显著高于对照组(p<0.01)处理组的GDP含量在第2、6、8周与对照组无显著性差异,在第4周显著低于对照组(p<0.01),第4周后上升,直至第10周显著高于对照组(p<0.01)处理组的UMP含量保持上升趋势,在第2、4周显著低于对照组(第2周,p<0.01；第4周,p<0.05),第6、10周时显著高于对照组(p<0.01),第8周时与对照组无显著性差异；处理组的UTP含量保持缓慢上升趋势,在第2、8周显著低于对照组(p<0.01),第4、6、10周时与对照组无显著性差异。处理组的CMP含量呈先上升、后稍微下降的变化趋势,在第2、6周与对照组没有显著性差异,在第4周显著低于对照组(p<0.01),此后上升,而到第8、10周时均显著高于对照组(p<0.01)对差异表达基因的分析显示肝纤维化小鼠模型中,在肝损伤早期下调的基因占主体,而在纤维化时期,表达上调的基因占大多数。这种变化趋势与纤维化过程中肝组织的核苷酸池的变化相一致。相关性分析发现：NMP含量的变化值与相对应的差异表达基因的变化值存在显著正相关关系,Pearson相关系数为0.961(双尾检验)；NMP的含量与纤维化指标(AST/ALT比值)也呈现显著正相关关系,Pearson相关系数为0.930(双尾检验)。核苷酸代谢途径的关键酶基因表达水平结果显示从头合成途径和降解途径的酶基因表达无明显变化,而挽救途径的腺嘌呤转磷酸核糖基酶基因表达发生了变化；纤维化相关的7个基因的表达水平测定结果显示它们的变化趋势与已报道的文献中的结果基本一致。肝