消退素D1在HaCat细胞及咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症中的抗炎作用及机制研究

消退素D1在HaCat细胞及咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症中的抗炎作用及机制研究第一部分SIRT1通过抑制NF-κB乙酰化减少脂多糖诱导的HaCaT细胞炎症因子分泌目的:研究消退素D1(resolvinD1,RvD1)对脂多糖(LPS)诱导的HaCaT细胞增殖的作用及机制。研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对脂多糖诱导的HaCaT细胞分泌炎症因子及NF-κBp65蛋白乙酰化的影响。方法:实验分为4组:正常对照组、LPS(10ug/ml)组、LPS(10ug/ml)+RvD1(100nmol/L)组和SIRT1RNAi组。首先采用CCK-8法检测RvD1及LPS对HaCaT细胞活力的影响;通过逆转录PCR(RT-PCR)检测脂氧素受体(ALX)、G蛋白偶联受体32(GPR32)及TLR4在HaCaT细胞上的表达情况;QRT-PCR检测不同时间点SIRT1mRNA水平;QRT-PCR及ELISA分别从mRNA及蛋白水平检测不同时间点IL-1β和TNF-α表达的变化情况;Westernblot检测SIRT1和NF-κBp65乙酰化蛋白的表达水平。结果:使用不同浓度的LPS及RvD1处理24h对HaCaT的细胞活力没有显著影响;HaCaT细胞表达ALX、GPR32及TLR4;RvD1可上调SIRT1mRNA水平;RvD1可从mRNA和蛋白水平显著降低炎症因子IL-1β和TNF-α的表达;LPS刺激可降低HaCaT细胞SIRT1蛋白的表达,同时增加乙酰化的NF-κBp65蛋白表达;RvD1可部分抑制LPS对SIRT1及乙酰化NF-κBp65的作用。结论:RvD1可能通过抑制NF-κBp65乙酰化,上调LPS引起的SIRT1抑制,从而抑制IL-1β和TNF-α的表达。第二部分脂多糖通过MAPKp38信号通路刺激HaCaT细胞分泌IL-1β目的:研究RvD1及LPS对HaCaT细胞凋亡的影响。研究LPS通过何种途径刺激HaCaT细胞炎症因子分泌。方法:采用流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡时,实验分为4组:正常对照组、LPS(10ug/ml)组、LPS(10ug/ml)+RvD1(100nmol/L)组和RvD1(100nmol/L)组。后续实验分为5组:对照组、LPS组、LPS+PD98059组,LPS处理前30min给予1?μMPD98059孵育、LPS+SP600125组,LPS处理前30min给予20?μMSP600125孵育及LPS+SB203580组,LPS处理前30min给予10?μMSB203580孵育。ELISA及QRT-PCR分别从蛋白水平及mRNA水平检测不同时间点IL-1β和TNF-α含量的变化情况;Westernblot检测MAPKs及NF-κBp65蛋白磷酸化水平;EMSA检测NF-κB与DNA结合活性。结果:RvD1对正常对照组及LPS刺激的HaCaT细胞均具有抑制增殖及凋亡作用;RvD1抑制MAPKs磷酸化;SB203580可从mRNA和蛋白水平显著降低炎症因子IL-1β表达;RvD1可抑制LPS激活的NF-κBp65核转位及DNA结合活性。结论:LPS通过MAPKp38信号通路刺激HaCaT细胞分泌IL-1β。第三部分消退素D1对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症的作用及机制研究目的:研究消退素D1(resolvinD1,RvD1)对咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症的作用及可能的机制,探讨RvD1治疗银屑病的可行性。方法:雄性8-12周龄BALB/c小鼠30只,背部剃毛,随机分为6组。(1)对照组;(2)咪喹莫特组;(3)IMQ+RvD1,1(1ug/kg)组;(4)IMQ+RvD1,5(5ug/kg)组(5)IMQ+RvD1,5+Boc组;(6)IMQ+Boc组。除对照组小鼠背部每日涂抹凡士林乳膏外,其余每周涂抹咪喹莫特乳膏,连续6天。涂抹前1小时腹腔注射RvD1或/和Boc预处理。采用PASI评分、皮损组织病理、表皮厚度及真皮内浸润炎症细胞数量等指标评价炎症程度,QRT-PCR及ELISA检测相关细胞因子mRNA及蛋白水平,Westernblot分析MAPKs及NF-κBp65核转录水平,EMSA检测NF-κBp65蛋白结合活性。结果:RvD1能明显减轻咪喹莫特诱导的小鼠背部皮肤炎症反应。RvD1能抑制MAPKs及NF-κBp65信号转导通路的激活,降低NF-κBp65蛋白结合活性,其保护作用与ALX/FPR2有关。而且ALX受体拮抗剂Boc不能加重IMQ诱导的炎症,可明显逆转RvD1对咪喹莫特诱导的小鼠皮肤炎症的改善作用。结论:我们的研究显示RvD1能显