酶与细胞的固定化

关于酶与细胞的固定化第一节：酶的固定化固定化酶的定义及其特点酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收使用.(不一定是固体)第2页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化酶的形状:

颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大，主要用于工业生产。第3页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化酶的优势：极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应酶反应过程能够加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反应；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高、成本降低。第4页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化酶的缺点：固定化时，酶的活力有损失；只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；增加了生产的成本，工厂初始投资大；与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离手续

第5页,共112页，2024年2月25日，星期天二：固定化酶的制备原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶高级结构的条件，固定化的条件要温和。固定化应有利于生产的自动化、连续化；固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用；固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；固定化酶成本要低，以利于工业使用。第6页,共112页，2024年2月25日，星期天问题固定化技术,固定化酶为什么要进行酶的固定化?固定化酶有何优劣性?固定化酶技术的基本原则有哪些?固定化酶就是使酶从游离状态变成固体?固定化酶的活力比游离酶高?固定化酶更有利于多酶反应?固定化酶可以节省成本?第7页,共112页，2024年2月25日，星期天三：酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但没有普遍适应的方法，必须根据不同酶及其不同的用途通过反复试验选择。第8页,共112页，2024年2月25日，星期天常用的固定化方法有：(按化学反应的类型分)

固定化方法分类固定化方法分类非共价结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法化学结合法交联法，共价结合法包埋法微囊法，网格法第9页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化酶的模式图第10页,共112页，2024年2月25日，星期天（一）非共价结合法包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法第11页,共112页，2024年2月25日，星期天结晶法：

就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性强,结构稳定其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所损耗.第12页,共112页，2024年2月25日，星期天分散法：就是通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。关键是解决酶在水不溶相中的分布以及酶在有机溶剂中的稳定性.第13页,共112页，2024年2月25日，星期天分散法：提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径：正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散（加入有利于分散的化合物,如PEG）；通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通过多相反应来实现酶的固定化；将酶吸附到多孔载体中；第14页,共112页，2024年2月25日，星期天物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构变化少，因而酶活力损失很少。缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等。第15页,共112页，2024年2月25日，星期天离子结合法：

酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等）优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。缺点：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强度和pH影响较大第16页,共112页，2024年2月25日，星期天（二）化学结合法包括：共价结合法；交联法第17页,共112页，2024年2月25日，星期天1．共价结合法：酶与载体以共价健结合的固定化方法，是载体结合法中最常用的方法。第18页,共112页，2024年2月25日，星期天1．共价结合法：结合方法优缺点：优点：与酶结合牢固，不容易脱落；缺点：反应条件苛刻，操作复杂，容易引起酶失活，酶活回收率低，甚至底物的专一性等也会发生变化。第19页,共112页，2024年2月25日，星期天1．共价结合法：结合方法主要有二种：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶联上去。第20页,共112页，2024年2月25日，星期天EE直接结合法通过双功能基团结合法载体双功能基团第21页,共112页，2024年2月25日，星期天1．共价结合法：所用载体包括：天然有机载体（如多糖，蛋白质，细胞）、无机物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚酯，聚胺，尼龙）合适的载体应具有良好的亲水性和一定的机械强度.天然高分子亲水性较好,但机械强度较差,玻璃和尼龙等强度好但亲水性较差.第22页,共112页，2024年2月25日，星期天共价结合的方式有多种方式进行反应,取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团.第23页,共112页，2024年2月25日，星期天载体上常用的功能基团包括:

芳香氨基,羟基,羧甲基,氨基等可以与载体结合的酶的功能基团包括：氨基,羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等参与共价结合的氨基酸不应是酶的必需基团结合基团第24页,共112页，2024年2月25日，星期天常见的结合方法有10种第25页,共112页，2024年2月25日，星期天结合方法：重点掌握溴化氰法活化基团最常见的方法:重氮偶联法;溴化氰法第26页,共112页，2024年2月25日，星期天结合方法：一.重氮反应(diazatitation):适合水不溶性的带芳香氨基的载体.载体在稀盐酸或亚硝酸钠中进行反应,成为重氮盐衍生物,然后再在温和的条件下和酶蛋白分子上相应的基团如酚羟基,咪唑基或氨基进行共价结合,得到固定化酶第27页,共112页，2024年2月25日，星期天重氮法是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。第28页,共112页，2024年2月25日，星期天

可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：a.多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-β-硫酸脂乙砜基胺(ABSE—)多糖(纤维素，葡聚糖，交联琼脂糖，交联琼脂及淀粉)属于此类载体。在碱性条件下用对—β—硫酸脂乙砜基胺活化多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：第29页,共112页，2024年2月25日，星期天b.氮基酸共聚体。如L—Leu和对氨基—DL—苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的L—Leu和对氨基—DL—Phe的N—羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进行反应制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。第30页,共112页，2024年2月25日，星期天c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bio—Gel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。第31页,共112页，2024年2月25日，星期天d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶．如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。第32页,共112页，2024年2月25日，星期天e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y—氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:第33页,共112页，2024年2月25日，星期天烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物:第34页,共112页，2024年2月25日，星期天此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合．产生固定化酶。第35页,共112页，2024年2月25日，星期天结合方法：二.异硫氰酸(或异氰酸)反应

iso(thio)cyanatereaction适合含芳香氨基的载体.芳香氨基先用硫光气处理成异硫氰酸(或异氰酸)盐的衍生物,然后在极温和的条件下和酶分子的氨基反应.在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性第36页,共112页，2024年2月25日，星期天第37页,共112页，2024年2月25日，星期天结合方法：三.溴化氰法:活化固相载体最早的方法之一,是活化多糖类载体的最盛行的方法,也是实验室和工业规模经常选用的方法第38页,共112页，2024年2月25日，星期天溴化氰—亚胺碳酸基反应含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。异脲型亚氨碳酸酯型氨基甲酸型最主要方式第39页,共112页，2024年2月25日，星期天溴化氰法的优缺点:优点:适用于多种载体的活化,不仅是多糖类,而且也适用于许多其他合成的含羟基的聚合物.其活化的载体可用于偶联小配基,以及含伯氨基的高分子聚合物操作简单重复性好.用于酶的固定条件特别温和.缺点:少量的持续不断的配基的脱落;有比较明显的非特异性吸附第40页,共112页，2024年2月25日，星期天溴化氰法实验方法:NaOH滴定的传统方法:用1L无离子水在玻璃漏斗中洗涤Sepharose4B,抽干成湿饼状并转移到500ml烧环中;胶悬浮在100ml无离子水中,并轻轻搅拌(不要使用磁力搅拌器)加入20gCNBr到凝胶悬浮液中,逐滴加入20%的NaOH,保持反应混合物的pH值在11,不时加入冰块到反应混合物中,保持温度在25℃当全部CNBr溶解时(10-15min),NaOH消耗速度将减少,此时,反应混合物倾入含冰的砂芯玻璃漏斗中,用1L冰冷的水和500ml冰冷的偶联缓冲液(pH8.5,0.1mol/LNa2CO3)快速地洗涤凝胶,由于活化载体不稳定,凝胶必须立即偶联蛋白质或其他配基.必须在通风橱中进行第41页,共112页，2024年2月25日，星期天四,芳香烃化反应:含羟基的载体可在碱性条件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反应,引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚羟基或巯基等偶联。五，叠氮反应：适用于含羟基，羧甲基等的载体，如CM-纤维素，葡聚糖，聚氨基酸等，可在酸等作用下转变为叠氮衍生物，然后在pH7.5-8.5和酶的氨基直接偶联。六，酰氯酰化反应：含羧基载体酸树脂可通过氯化亚砜处理后生成活泼的酰氯衍生物，再与酶共价结合。第42页,共112页，2024年2月25日，星期天七,酸酐反应:乙烯等和顺丁烯二酸酐的共聚物，可通过其活泼的酸酐基直接和酶的氨基偶联，生成固定化酶。八，缩合反应：利用羰二亚胺的活化作用，使氨基和羧基直接偶联缩合形成肽键的反应九，巯基-二硫基交换反应：带巯基和二硫基的载体可通过巯基-二硫基交换反应和酶分子上的非必需巯基偶联。十，直接法或涂层法第43页,共112页，2024年2月25日，星期天交联法：

就是利用双功能或多功能试剂使酶与酶，酶与蛋白，或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，该法也是利用共价健固定酶的，所不同的是它不使用载体。最常用的交联剂是戊二醛。参与交联的基团有:a-氨基,-NH2（Lys）,-SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等第44页,共112页，2024年2月25日，星期天第45页,共112页，2024年2月25日，星期天交联反应可发生在分子间或分子内；其比例在一定程度上和酶的浓度与交联试剂的浓度有关，也与pH、离子强度有关。一般而言：低酶浓度下主要形成分子内交联，交联后的酶仍呈溶解状态；高浓度下分子间交联增加，形成的固定化酶往往变为不溶态。交联剂与酶的最适比为10%左右（w/w)，但并不是适用于一切的。第46页,共112页，2024年2月25日，星期天交联法优缺点及措施：

优点：操作简便缺点：反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低对策：尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活力的提高。采取某些保护措施：利用可逆抑制剂或底物保护活性中心。或添加惰性蛋白。第47页,共112页，2024年2月25日，星期天（三）包埋法可分为网格型和微囊型两种，将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。通常采用惰性材料的载体第48页,共112页，2024年2月25日，星期天优点：包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。缺点：包埋时可能发生化学聚合反应使酶失活，只适合小分子底物和产物，不适合大分子底物和产物。第49页,共112页，2024年2月25日，星期天1.网格型:

将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型。是固定化微生物中用得最多,最有效的方法.载体主要有丙烯酰胺、聚乙烯醇、和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、明胶、胶原、海藻酸等天然高分子化合物。合成高分子化合物包埋通常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方法；对天然高分子化合物则采用于溶胶状的高分子化合物中加入酶和微生物再将之凝胶化的方法。第50页,共112页，2024年2月25日，星期天例如:琼脂糖包埋法是，将1％一2.5％的琼脂糖加热溶解后冷至37—38℃,与一定量动物细胞混合后．分布于石蜡油中.使温度由37℃降至10℃左右，可得到直径为0.1—0.3mm的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产。第51页,共112页，2024年2月25日，星期天2．微囊型：将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。其颗粒比网格型小得多，有利于底物和产物的扩散，但是反应条件要求高，制备成本也比较高例如：先用海藻酸钙包埋动物细胞制成胶粒后，再在外面包一层聚Lys膜，然后放入柠檬酸钠溶液中去除海藻酸钙，便可获得由多聚Lys包埋的动物细胞。第52页,共112页，2024年2月25日，星期天(3)脂质体（liposome)包埋法脂质体：具有双层结构和一定包裹空间的微球体，它具有多层囊胞结构（MLV），单层小囊泡（SUV），单层大囊泡（LUV）等三种类型。特点：一定的机械性能，能定向将酶等包裹物质携带到一定部位然后释放，具有更大的定向性；比较安全，回收率高。缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。第53页,共112页，2024年2月25日，星期天问题1固定化酶有哪些方法?它们各有什么特点?利用结晶法固定化酶需要载体?不需要载体的固定化方法包括哪些?非共价固定化酶的方法一般不改变酶的共价结构.共价法固定化酶一定改变酶的共价结构?分散法固定化酶就是将酶分散于水溶液中进行催化反应?第54页,共112页，2024年2月25日，星期天问题2如何提高分散法固定化酶的催化效率?吸附法固定酶,离子交换法固定化酶?离子交换法所采用的载体应该带有与蛋白质相反的电荷?pI6.5的酶在pH8.3环境中应该与什么载体结合(DEAE或CM纤维素?)可以进行共价固定化的载体基团主要包括?可以进行共价固定化的蛋白质侧链基团主要包括?第55页,共112页，2024年2月25日，星期天问题3共价固定化就是将酶直接通过某种方式共价连接到载体的功能基团上?针对芳香氨基有哪些固定化方法?描述重氮偶联法的过程.重氮偶联法基团活化时利用了盐酸,在很酸条件下进行,哪么为什么酶不会大部分失活?可以与重氮衍生物结合的基团有哪些?含有芳香氨基的载体包括哪些?重氮偶联法具有比较高的专一性?第56页,共112页，2024年2月25日，星期天问题4异硫氰酸法是针对什么基团的载体进行的?基本过程?生物的活化结构是什么?能与蛋白质上的什么基团连接?对多糖类的载体,一般采用什么方法进行固定化?溴化氰法的原理?基本过程如何进行?溴化氰法的优缺点?溴化氰法为什么要加入NaOH?溴化氰法与酶结合时以什么方式为主?第57页,共112页，2024年2月25日，星期天问题5包埋法属于共价还是非共价固定化?有什么优劣?包埋法的原理及基本种类?举例说明各种包埋法?交联法常用的交联剂是什么?交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高?第58页,共112页，2024年2月25日，星期天四．固定化酶的性质酶的性质?第59页,共112页，2024年2月25日，星期天（一）固定化后酶活力的变化：固定化酶的活力一般比天然酶小，专一性也有所变化。原因可能有：固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），影响到活性中心与底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心接近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接触。第60页,共112页，2024年2月25日，星期天问题固定化后酶的活力一定下降?一般会下降?原因是什么?第61页,共112页，2024年2月25日，星期天（二）固定化对酶稳定性的影响：在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所提高；表现在：热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；对不同pH稳定性、蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有影响。有报道有些固定化酶经过贮藏后，其活性提高了第62页,共112页，2024年2月25日，星期天问题固定化后酶的活力上升了?固定化后酶的稳定性上升了?也可能下降?为什么?第63页,共112页，2024年2月25日，星期天（三）固定化酶的最适温度变化：

由于固定化后酶的热稳定性提高，因此其最适温度也提高了，这对于生产上非常有利。第64页,共112页，2024年2月25日，星期天问题固定化后酶的最适温度上升的主要原因是什么?第65页,共112页，2024年2月25日，星期天（四）固定化酶的最适pH变化：固定化酶的最适pH值常常发生偏离,主要是微环境表面的电荷性质的影响.如何变化?载体带正电荷则最适pH上上升偏低?第66页,共112页，2024年2月25日，星期天（五）固定化酶的米氏常数(Km)的变化:

固定化酶的表观米氏常数Km值随载体的带电性能变化.当酶结合于中性载体时,由于扩散限制造成表观Km值的上升;与载体电荷相反的底物在固定化酶微环境中浓度比整体溶液高,则固定化酶的表观Km值下降;(一定降低吗?)而载体电荷与底物相同,就会造成固定化酶的表观Km值显著增加.第67页,共112页，2024年2月25日，星期天问题固定化酶的Km值必定大于游离酶?固定化后Km值上升意味着酶的性质发生了变化?第68页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化酶性质发生变化的原因：固定化改变了酶的结构或构象；固定化后酶催化反应的空间障碍、扩散限制效应；载体性质引起的分配效应及其对酶和反应体系性质的影响。第69页,共112页，2024年2月25日，星期天五.影响固定化酶性能的因素:包括：质量传递效应和支持物产生的（静态的）和反应产生的（动态的）质子梯度：第70页,共112页，2024年2月25日，星期天(一)质量传递效应:

由于空间位阻、离子强度变化或其他因素导致溶质在反应体系中运动性能受到影响，这种现象称质量传递效应。对于固定化酶，由于质量传递效应能引起反应速率的降低，因此和天然酶相比，其催化效率有所降低。增强催化效率的一些方法：降低颗粒大小；对于比活力高的酶应降低酶的负载量；使酶在载体的外部优先结合。第71页,共112页，2024年2月25日，星期天(二)支持物产生的（静态的）和反应产生的（动态的）质子梯度：

静态质子梯度：由于溶质分子的带电基团和载体上的静电荷相互作用（分配作用）所引起的在固定化酶周围空间和整个反应体系之间形成的质子梯度。动态质子梯度：固定化酶所催化的反应释放质子或吸收质子，可造成酶周围环境中质子浓度和反应体系中质子浓度的差异，这种梯度随着反应的进行而不断变化，受反应体系中酸碱缓冲系统的缓冲能力和质量传递效应的影响。动态质子梯度对固定化酶催化的反应效率有重要的影响。第72页,共112页，2024年2月25日，星期天建议缩小反应产生的动态pH梯度的作用，可以通过下面几种方法达到：对于底物介导的扩散控制，分别或同时减少酶浓度或颗粒大小；使用足够容量的缓冲液来减少动态pH梯度；采用比该酶最适pH高的外部pH进行操作；共固定一个质子消耗酶，它能原位形成氨并中和产生的质子；第73页,共112页，2024年2月25日，星期天复习问题概念:固定化;固定化酶;结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法;交联法;包埋法为什么要进行酶的固定化?固定化酶有什么优缺点(相对游离酶)?固定化酶的方法有哪些分类?共价法和非共价法的比较?常见非共价法?常见共价法?固定化酶的制备原则?第74页,共112页，2024年2月25日，星期天常见固定化酶的载体可以活化的基团包括哪些?针对这些基团的相应活化方法?掌握重氮反应法\异硫氰酸法\溴化氰法:针对的载体基团,可以结合的酶的基团,关键结构,选择性?溴化氰法的基本过程.什么叫溴化氰法？其原理是什么？其应用的优缺点？举例说明一个典型利用溴化氰法进行共价固定的实验。掌握包埋法,交联法的概念?主要关联剂,关联的程度与浓度的关系?包埋法的主要种类.可以用于固定化的蛋白质上的基团包括什么?第75页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化引起酶的性质发生变化的原因?固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.第76页,共112页，2024年2月25日，星期天第三节:辅酶的固定化一、辅酶的定义及分类：辅因子:有些酶的催化作用必须在一些非蛋白质成分的物质的参与才能进行,这些小分子物质统称辅因子.第77页,共112页，2024年2月25日，星期天为什么辅酶要固定化?酶的作用往往需要辅酶辅酶一般价格比较昂贵辅酶不容易回收第78页,共112页，2024年2月25日，星期天（二）固定化难题及措施：辅酶分子量小，难以包埋在半透膜中，若固定化在不溶性载体上，则会影响其在多个酶之间的传递作用，目前都是将辅酶结合于水溶性高分子载体，使其高分子化来解决辅酶的固定化难题：1）引入功能团和间隔臂；（主要功能团有氨基和羧基）2）高分子化；（碳亚二胺法）。第79页,共112页，2024年2月25日，星期天二、载体和方法最常用的载体是琼脂糖，其次还有纤维素、玻璃珠及合成高分子载体等。常用共价偶联法固定化辅酶或辅基，一般采用溴化氰法、碳亚二胺法以及重氮偶联法。第80页,共112页，2024年2月25日，星期天二、辅酶的固定化方法（一）辅基辅酶固定化的一般步骤：

1．首先，选择合适的载体；2．其次，选择合适的间隔臂；3．引入适当的功能基团或利用辅基本身合适的功能基团将辅基偶联到载体上。第81页,共112页，2024年2月25日，星期天（二）辅酶的固定化实例：辅酶的固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法、碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后用在超滤器中。NAD+通过通过共价偶联法在琼脂糖上的固定化步骤：用碘乙酸使NAD+/NADH腺嘌呤中的1位氮原子烷基化;在碱性条件下分子发生重排得到6位碳上的氨基氮被修饰的衍生物N-羧甲基NAD+;通过碳二亚胺法使长链接臂分子已二胺-1,6与NAD+衍生物的羧基偶联;长臂上另一端的氨基再与经过溴化氰CNBr活化了的琼脂糖偶联,从而得到固定化的辅酶.第82页,共112页，2024年2月25日，星期天第83页,共112页，2024年2月25日，星期天第84页,共112页，2024年2月25日，星期天溴化氰法活化载体可直接与辅基偶联。第85页,共112页，2024年2月25日，星期天复习问题为什么要进行辅酶固定化?进行辅酶固定化与酶固定化的主要差别?应该注意的关键问题是什么?难点及解决方式?常见固定辅酶的方法有哪些?第86页,共112页，2024年2月25日，星期天第四节：细胞的固定化固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。第87页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化细胞相对固定化酶的优势在于：固定化细胞保持了细胞内酶系统的天然环境，因而更加稳定；固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统，这对于多步催化转换，其优势更加明显；无需辅酶的再生。固定化细胞有利于提高基因工程菌的稳定性、生物量和克隆基因产物的产量。成本低适合多酶反应环境天然活性保持好稳定性固定得率高第88页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化细胞的局限性：仅利用胞内酶；可能形成不需要的副产物；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用，载体形成的孔隙大小影响底物分子的通透性。第89页,共112页，2024年2月25日，星期天一．固定化细胞的分类、形态特征和生理生态状态1．固定化细胞的分类：按细胞类型分为固定化植物、动物和微生物细胞三大类；按细胞生理状态可分为固定化死细胞和固定化活细胞。固定化生长细胞（固定化增殖细胞）：是将活细胞固定化在载体上使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。其优点是：反应所需的酶可以不断更新；而且反应酶处于天然环境中，更加稳定，因此更适合多酶顺序连续使用。固定化死细胞:比较适合于单酶催化反应,可以增加细胞的通透性.第90页,共112页，2024年2月25日，星期天固定化增殖细胞发酵具有显著的优势：固定化细胞密度大，可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微生物菌体的培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用；发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等第91页,共112页，2024年2月25日，星期天2．固定化细胞的形状：颗粒状、块状、条状或不规则状。目前多制成颗粒状珠体。第92页,共112页，2024年2月25日，星期天二．固定化细胞的制备：固定化细胞和固定化酶的制备方法基本相同;固定化细胞的方法有多种,但没有一种理想的通用方法;高的活力保留和操作的稳定性是固定化生物催化剂的评价先决条件.第93页,共112页，2024年2月25日，星期天三、固定化细胞的性质：以固定化基因工程菌为例,固定化细胞具有高细胞浓度、高效克隆产物表达和良好的稳定性等特征：（一）目的产物的产量提高；（二）克隆基因产物高效表达并且稳定性也明显提高；（三）质粒的遗传稳定性明显提高；第94页,共112页，2024年2月25日，星期天复习问题为什么要进行细胞固定化?细胞固定化相对固定化酶有什么优缺点及其应用领域?第95页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征评价固定化酶（细胞）的指标固定化酶（细胞）的活力测定：应注明反应温度、pH、底物外，还应流注明搅拌速度、搅拌时间、测定系统类型活力单位定义及表示方法:μmol.min-1.mg-1;或μmol.min-1.cm-1(酶板、酶管、酶膜）固定化酶活力的测定方法与游离酶不同,要做适当的改进之后才能用于固定化酶的测定;目前有二种基本的测定系统:填充床和均匀悬浮保温系统.第96页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征测定方法分为间歇测定和连续测定两种:间歇测定:在搅拌或振荡反应器中,间隔一定时间取样,过滤后按常规进行测定.此法简单,但受反应器形状、大小及反应液量影响，必须固定条件下测定；尽可能在达到最高反应速度的振荡或搅拌条件下进行。连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速与酶活力的关系算出酶活力。测定条件要尽量与工程条件相同。第97页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征2.偶联率及相对活力的测定:活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比.即:固定化酶总活力/加入酶总活力*100%偶联率:载体上固定的蛋白量占加入蛋白总量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白总活力*100%相对活力：固定化酶总活力/（加入酶总活力-上清液中末偶联的酶活力）*100%第98页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征3.固定化酶(细胞)的半衰期固定化酶(细胞)在连续测定条件下,活力下降为最初活力一半时所经历的时间,称为半衰期.半衰期是衡量固定化酶(细胞)稳定性的指标.T1/2=0.696/KDKD(衰减常数）=(-2.303/t)(lgE/E0)第99页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征二、载体活化程度和固定化配基密度的测定（一）活化程度的测定：常用茚三酮法测定载体活化的程度：茚三酮与伯胺反应生成一种带色的复合物，叫赫曼紫，这种反应能用于测量结合到不溶性载体上的自由伯胺的数量，载体的活化程度可通过测定伯胺的数量来衡量。第100页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征二、载体活化程度和固定化配基密度的测定（二）固定化的蛋白质测定：1.双辛可宁酸法(BCA)2.考马斯亮蓝法第101页,共112页，2024年2月25日，星期天第五节固定化酶和固定化细胞的表征二、载体活化程度和固定化配基密度的测定（三)氨基、酰肼或巯基的定量测定利用2，4，6-三硝基磺酸盐