细菌内毒素检查法凝胶法

关于细菌内毒素检查法凝胶法细菌内毒素检查法

凝胶法方法分类 浊度法光度法显色基质法重现性好方法特性能定量能控制药物的增强/抑制干扰操作简便。节省时间第2页,共14页，2024年2月25日，星期天原理：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关.第3页,共14页，2024年2月25日，星期天第4页,共14页，2024年2月25日，星期天细菌内毒素检测之凝胶法实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、内毒素限值的确定3、确定最大有效稀释倍数4、凝胶限度试验5、结果判定第5页,共14页，2024年2月25日，星期天要求1、以最终产品为检测必要（浓度超过0.5mg/ml）2、检测样品PH应在6~8之间，不符应调整第6页,共14页，2024年2月25日，星期天1、试验准备：试剂、仪器及用具

仪器与器具电热恒温水浴锅、定时钟、去热源枪头和小玻璃瓶、移液枪、试管架、剪刀、锡箔纸。试剂细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂。第7页,共14页，2024年2月25日，星期天2、内毒素限值的确定

L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示。一般由供试品提供者直接提供内毒素限值如1000EU。第8页,共14页，2024年2月25日，星期天3、确定最大有效稀释倍数

（MVD）：MVD=cL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。第9页,共14页，2024年2月25日，星期天3、鲎试剂灵敏度复核

按下表制备溶液A、B、C，使用稀释倍数为MVD的供试品溶液来制备溶液A，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

BCAA鲎试剂200ul100ul100ul100ul标准品100ul供试品100ul100ul第10页,共14页，2024年2月25日，星期天6、结果判定

将制备好的试剂用锡箔纸包裹好后放入电热恒温水浴锅中，37℃恒温水浴60min后观察结果（保证玻璃瓶中溶液处于水面以下，并防止水进入瓶中）。若阴性对照溶液B为阴性，阳性对照溶液C为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定

第11页,共14页，2024年2月25日，星期天操作注意事项试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。2、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。实验人员：戴干净手套和口罩。第12页,共14页，2024年2月25日，星期天实验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。2、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。3、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。4、操作时间的长短。环境温度变化都