分子遗传学标志检测在白血病分型中应用

分子遗传学标志检测在白血病分型中的应用上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所陈冰白血病相关细胞-分子遗传学标志LookAT.Science,278:1059——急性髓细胞白血病(AML)的细胞-分子遗传学标志染色体易位受累基因FABt(15;17)(q22;q21)PML;RARaM3t(8;21)(q22;q22)ETO;AML1M2b,M4inv(16)(p13q22)MYH11;CBFbM4Eot(9;11)(p22;q23)MLLT3;MLLM5t(6;9)(p23;q34)DEK;CANM2inv(3)(q21q26)EVI1;RPN1t-AMLAML相关细胞-分子遗传学标志(1)染色体易位受累基因FABt(1;11)(q23;p15)PMX1;NUP98M4,M5t(3;5)(q25;q34)MLF1;NPMMDS,AMLt(3;21)(q26;q22)EVI1;AML1t-AML,CML-BCt(5;12)(q33;p13)PDGFRb;TELCMML,a-AMLt(5;17)(q34;q21)NPM;PLZFM3*t(6;11)(q27;q23)AF6;MLLM4,M5t(7;11)(p15;p15)HOXA9;NUP98M2AML相关细胞-分子遗传学标志(2)染色体易位受累基因FABt(8;16)(p11;p13)MOZ;CBPM5bt(9;22)(q34;q11)ABL;BCRM1,M2,CMLt(11;17)(q23;q21)PLZF/NuMa;RARaM3*t(11;19)(q23;p13)MLL;ENL/ELL/EENM4,M5inv(11)(p15q22)NUP98;DDX10t-MDS,t-AMLt(12;22)(p13;q11)TEL;MNL1AMLt(16;21)(p11;q22)FUS;ERGM5AML相关细胞-分子遗传学标志(3)受累基因受累基因NPM1突变WT1突变CEBPA突变ASXL1突变C-KIT突变IDH1突变FLT3(ITD/TKD)突变IDH2突变MLL-PTD突变TET2突变DNMT3A突变EVI1高表达N-RAS突变……AML相关细胞-分子遗传学标志(4)1185例不同亚型AML诊断和预后分子标志的分布CBF白血病M3Shenetal.Blood,188:5593Kaplan-MeiercurvesforOSandEFSaccordingtogenotypeswithstatisticalsignificanceinmultivariateanalysis.AllAMLpatientswithoutcytogeneticprognosticmarkerscouldbedividedintothreeprognosticgroupsusingfourmarkercombinations:Lowrisk,bi-allelicCEBPAm+and/orNPM1m+/DNMT3Am-;Highrisk,DNMT3Am+and/orMLLm+;Intermediate,allremainingcases.

605例无细胞遗传学预后标志的AML患者预后分组AML细胞-分子遗传学异常预后危险度分层国内专家共识细胞遗传学分子标志Low-riskinv(16)/t(16;16)正常核型伴孤立的NPM1突变t(8;21)t(15;17)Intermediatenormalt(8;21)/inv(16)伴C-KIT突变+8t(9;11)othersHigh-riskComplex(>=3)正常核型伴单独的FLT3-ITD突变-5/5q-;-7/7q-11q23

[除外t(9;11)]inv(3)/t(3;3)t(6;9)t(9;22)——急性淋巴细胞白血病(ALL)的细胞-分子遗传学标志Pui.NEnglJMed,350:1535ALL相关染色体易位(1)染色体易位受累基因FABt(1;7)(p34;q34)TAL1;TCRbT-ALLt(1;7)(p34;q34)LCK;TCRbT-ALLt(1;11)(p32;q23)AF1P;MLLL1t(1;14)(p33;q11)TAL1;TCRdT-ALL,L1t(1;19)(q23;p13)E2A;PBX1前B-ALL,L1t(2;8)(p12;q24)IGK;MYCB-ALL,L3t(4;11)(q21;q23)AF4;MLLB祖-ALL,L1,L2ALL相关染色体易位(2)染色体易位受累基因FABt(7;9)(q35;q34)TCRb;TAN1T-ALLt(7;9)(q34;q32)TCRb;TAL2T-ALLt(7;10)(q35;q24)TCRb;HOX11T-ALLt(7;11)(q34;p13)TCRb;RHOM2T-ALLt(7;19)(q34;p13)TCRb;LYL1T-ALLt(8;14)(q24;q11)MYC;TCRa/TCRdT-ALLt(8;14)(q24;q32)MYC;IGHB-ALL,L3t(8;22)(q24;q11)MYC;IGLB-ALL,L3ALL相关染色体易位(3)染色体易位受累基因FABt(9;22)(q34;q11)ABL;BCR前B-ALL,L1,L2t(10;14)(q24;q11)HOX11;TCRdT-ALLt(11;14)(p13;q11)LMO2;TCRa/TCRdT-ALLt(11;14)(p15;q11)LMO1;TCRa/TCRdT-ALLt(11;19)(q23;p13)MLL;ENLB-ALL,L1,L2t(12;21)(p13;q22)TEL;AML1B祖-ALLt(14;18)(q32;q21)IGH;BCL2B-ALL,L2,L3t(17;19)(q22;p13)HLF;E2A前B-ALL,L1(1346例不同亚型ALL诊断和预后分子标志的分布Chenetal.Leukemia,26:1608PhnegativeB-ALL中重要的预后相关分子标志Mietal.Leukemia,26:1507IKZF1CRLF2Low-riskt(12;21)/TEL-AML1t(1;19)/E2A-PBX1hyperdiploidy(51-65

chromosomes)IntermediatenormalothernumericalchangesCRLF2-overexpressionnon-translocationstructural(≤2chromosomes)othersimpletranslocationHigh-riskt(11q23)/MLL-translocationt(9;22)/BCR-ABL

Ik6variantofIKZF1genecomplexkaryotype(≥3chromosomes)分子遗传学检测技术在白血病诊断分型中的应用核型分析细胞遗传学基础正常人类染色体分组组别编号大小着丝粒位置随体次缢痕其他A1~3最大中或亚中部无1qB4~5大亚中部无无C6~12中亚中部无9qX染色体大小与C组相似D13~15中近端部可有E16~18小中或亚中部无16qF19~20次小中部无G21~22最小近端部可有YqY染色体大小与G组相似常见染色体异常——数目异常单倍体：

n多倍体：

3n或4n非整倍体： 单体：monosomy

三体：trisomy*非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失常见染色体异常——结构异常缺失：deletion重复：duplication易位：translocation等臂染色体：isochromosome插入：insertion倒位：inversion臂内臂间白血病细胞遗传学研究方法——标本来源和采集骨髓： 3-5ml；

*取自肿瘤组织本身外周血： (1)WBC>10x109/L; (2)原、幼细胞百分比>10%

*分裂相均来源于白血病细胞 *无脂肪颗粒，标本质量好淋巴结： 穿刺液或活检标本

*骨髓浸润时可用骨髓标本白血病细胞遗传学研究方法——染色体制备方法直接法：

不经培养立即处理短期培养法：

按1-3x106/ml细胞密度接种到培养基

培养24-48h同步法：

应用MTX或Fdu处理17h，使其同步化白血病细胞遗传学研究方法——染色体显带Q带： 荧光很快褪色，标本不易保存C带： 染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大G带： 带纹细致，解象力强

末端呈浅带，不利于该区异常的识别 对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定R带： 带型与Q、G带相反

除Y染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位

方法简便，重复性好，可成批显带 对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高

带纹不如G带精细，难以识别微小异常 核型分析的优缺点直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常为形态学检查，灵敏度有限必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核荧光原位杂交（FISH）染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用FISH的基本原理：单链DNA（探针）和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火杂交DenatureHybridization单一序列基因探针（单标、双标）染色体着丝粒探针染色体涂色探针M-FISHFISH探针的选用：白血病的染色体异常：染色体数目异常的检测染色体结构异常的检测易位倒位FISH在白血病中的应用:白血病的MICM诊断---常见染色体易位的检测鉴别标志染色体,发现、确定新的染色体易位，

有助于定位克隆新的疾病基因白血病疗效判断,鉴定BMT后造血细胞的克隆起源白血病预后判断,检测微小残留病和监测早期复发FISH正常信号FISH融合信号（间期核）单一基因探针单标记FISH

inv(16)M4EoFISH探针的选用：单一基因探针双标记FISH

t(15;17) M3(APL) t(8;21) M2b/M4 t(9;22) CMLFISH探针的选用：Chr22(BCR)Chr9(ABL)der9(ABLconBCR)der22(ABLconBCR)染色体着丝粒探针检测染色体数目异常染色体定位标记着丝粒及着丝粒周染色体易位FISH探针的选用：全染色体涂抹

(Chromosomepainting)FISH探针的选用：chr8dup8FISH检测的优点（1）直观，是细胞遗传学和分子生物学之间的桥梁敏感性和特异性高能分析一部分显带技术不易分辨的异常，

如某些倒位、丢失、复杂畸形等FISH检测的优点（2）与细胞形态学结合，有助于深入理解疾病的

发病机制能检测石蜡固定和Right’s染色标本多色FISH可在同一标本上同时检测多种序列。FISH检测的优点（3）间期核FISH：

不需体外培养，对非分裂细胞即可快速检测

可对终末分化的细胞进行检测

在极短的时间内可检测大量细胞FISH检测的缺点染色体异常的检测受限于相应探针的获得对三体检测的敏感性高于对单体或缺失的检测标本的限制（骨髓、外周血标本优于实体瘤或石蜡包埋、冰冻切片标本）一次杂交只能检测1至数个异常，不能同时对整个基因组的染色体数目、结构异常进行检测M-FISH（Multiplex-FISH）

特殊FISH探针的选用CombinatorialM-FISHCOBRAM-FISHM-FISH基本原理（1）CombinatorialM-FISH

12345678910111213141516171819202122XYFITCXXXXXXXXXXXCy3XXXXXXXXXXCy3.5XXXXXXXXXXXCy5