ABO血型分子基础与应用

ABO血型分子基础与应用ABO血型分子基础与应用ABO血型分子基础与应用ABO血型基本知识Landsteiner1900年发现ABO血型ＡＢＯ是目前35个血型系统中最为重要的一个血型系统４种表型抗原：Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢABO血型抗原主要分布在红细胞上，同时分布在白细胞、血小板和组织细胞上分泌型ABO血型抗原为半抗原，分布在唾液、血清、尿液、精液和羊水等中ABO血型抗原存在发育的过程通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。ABO血型分子基础与应用ABO血型分子基础与应用ABO血型分1ABO血型基本知识Landsteiner1900年发现ABO血型ＡＢＯ是目前35个血型系统中最为重要的一个血型系统４种表型抗原：Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢABO血型抗原主要分布在红细胞上，同时分布在白细胞、血小板和组织细胞上分泌型ABO血型抗原为半抗原，分布在唾液、血清、尿液、精液和羊水等中ABO血型抗原存在发育的过程ABO血型基本知识Landsteiner1900年发现AB2成人与新生儿ABO抗原数量比较成人与新生儿ABO抗原数量比较3ABO血型基本知识ＡＢＯ血型抗原为糖蛋白和糖脂构成的多态性多糖链ABO血型抗原的蛋白结构：前体物质+H物质(L岩藻糖）+/-特异性糖（N-乙酰半乳糖胺/D-半乳糖）ABO血型基本知识ＡＢＯ血型抗原为糖蛋白和糖脂构成的多态性多4ABO血型分子基础与应用5ABO血型鉴定ABO血型鉴定6ABO亚型发现ABO亚型ABO血型鉴定时正反定型不符正反定型是相符的,但某些反应的强度较弱——没有血液系统的疾病,正定型在试管法中应该有“4+”强度的凝集,否则极有可能是ABO亚型——反定型,凝集强度<2+,甚至仅存在冷反应性不规则抗-A或抗-B,这也提示有可能存在亚型。通过反定型减弱预判亚型的可靠性远低于正定型减弱ABO亚型发现ABO亚型7ABO亚型正定型的凝集强度与凝集状态

A2亚型与合格的人源抗-A试剂反应,可以达到4+,Ax形成的凝集一般≤2+,混合视野凝集中凝集的红细胞≥50%,通常判定为A3或B3型,混合视野凝集中凝集的红细胞<10%,则通常判定为“Aend”或“Bend”。部分亚型红细胞和抗体在4℃放置10-30min后,凝集强度会显著增强ABO亚型正定型的凝集强度与凝集状态8各种A亚型血清学表现各种A亚型血清学表现9各种弱A亚型的鉴别程序各种弱A亚型的鉴别程序10ABO亚型的分布最常见的ABO亚型存在于A型人群中,A型个体大多数属于A1型,少数属于Aint、A2型。ABO亚型的分布11ABO亚型的分布Aint可以看做是A1和A2型的过渡型,数量多于A2型除去A1、Aint、A2型之外,其他ABO亚型相当罕见,根据现有数据,在我国约为1.5/1万或略多,而且B亚型的数量明显多于A亚型类孟买型在我国不同区域人群中的分布比例约为1/8000—1/16000ABO亚型的分布Aint可以看做是A1和A2型的过渡型,12ABO亚型的分布ABO亚型的分布13ABO血型基因ABO位点9q34.1－9q34.27个外显子，跨越基因组DNA18kb外显子1～7，28bp～691bp不等主要编码顺序：exon6和exon7ABO血型基因ABO位点9q34.1－9q34.214ABO血型基因ABO抗原不是ABO基因的直接产物——A基因：α(1,3)N-乙酰氨基半乳糖基转移酶——B基因：D半乳糖基转移酶——O基因：无有效的基因产物ABO血型基因ABO抗原不是ABO基因的直接产物15ABO血型基因ABO基因的参比序列：A*101在A1基因的基础上核苷酸突变糖基转移酶改变影响催化活性抗原改变A和B基因ｃDNA序列有7个碱基不同，其中４个引起氨基酸的替换，分别是176、235、266和268O基因在261位单碱基缺失造成移码突变，终止密码提早出现，其它序列与A相同ABO血型基因ABO基因的参比序列：A*10116ABO基因在cDNA和氨基酸上的差异A1allele(A*101)A1allele(A*102)nt467(C→T)=>aa156(pro→leu)Ballelent291(A→G)；

nt526(C→G)=>aa176(Arg→Gly)；nt657(C→T)；

nt703(G→A)=>aa235(gly→Ser)；

nt796(C→A)=>aa266(leu→Met)；

nt803(G→C)=>aa268(Gly→Ala)；nt930(G→A)。Oallele(O*101)nt261(G→del)=>framshiftOallele(O*102)nt261(G→del)=>framshift,nt297(A→G),nt646(T→A),nt681(G→A),nt771(C→T),829(G→A)ABO基因在cDNA和氨基酸上的差异A1allele(A17ABO血型分子基础与应用18中国汉族群体ABO基因分布中国汉族群体ABO基因分布19O/B基因杂交产生Ax表现型O/B基因杂交产生Ax表现型20母亲B型，父亲O型，孩子A型，属于明显的一级父源排除关系。Suzukietal.提出母亲生殖细胞系形成时发生B和O1等位基因交换，形成B-O融合基因，编码一个有A转移酶活性的基因产物，因为第7外显子来自O1基因，与A1基因第7外显子具有相同的序列。母亲B型，父亲O型，孩子A型，属于明显的一级父源排除关系。S21常见A亚型的分子基础常见A亚型的分子基础22常见B亚型的分子基础常见B亚型的分子基础23cisAB与B（A）的分子基础极少数人类个体的一条染色体中同时存在一个cisAB或B（A）基因，它编码的酶可以同时催化A抗原和B抗原的合成。cisAB或B（A）是从一个亲本遗传而来的，因此即便其基因型是cisAB/O或B（A）

/O，也会表现为AB型，若与O型血的人（基因型O/O）生育，子女的血型可能是AB或O，而不像通常AB型血与O型血的父母只能有A或B型血的子女。cisAB与B（A）的分子基础极少数人类个体的一条染色体中同24cisAB与B（A）的分子基础CisAB与B（A）——4个关键位置氨基酸替代A糖基转移酶:AAAAB糖基转移酶:BBBBcisAB酶：AAAB；BBAB等B(A)酶：BABB；BBBB等cisAB与B（A）的分子基础CisAB与B（A）——4个关25孟买型与类孟买型的分子基础孟买型属H缺乏的非分泌型，其个体红细胞和分泌液中均检测不到ABO抗原。类孟买血型是H缺乏的分泌型，其特点是红细胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中却可以找到ABH血型物质。孟买型与类孟买型的分子基础孟买型类孟买血型26ABO血型亚型与突变基因关系ABO亚型的基础是基因改变ABO突变基因种类远远多于根据ABO血清学亚型数量,目前发现的形成亚型的突变基因超过100种(Genbank中登记的超过200种）每1种ABO亚型可以由多种不同的突变的ABO基因决定,不同的基因型之间往往可产生细微的血清学表现差异血清学表现存在个体差异,相同的突变基因可产生略有不同的血清学结果严格划分不同ABO亚型的突变基因比较困难ABO血型亚型与突变基因关系ABO亚型的基础是基因改变27ABO血型亚型与突变基因关系血清学检测易受主客观因素的影响，常常遇到和任何现有亚型血清学特点均不能完全相符的情况，在没有确切的证据证明为1种新的ABO亚型之前，根据其主要的血清学特点,，将其纳入现有的亚型框架合理的定义ABO亚型，可以使我们大致了解该1份血标本表达的ABO抗原强度,是否存在或容易产生不规则抗-A、抗-B与抗-H,是否存在相应血型物质等线索,对其临床意义、遗传特性的判断等也能提供很有意义的信息已有报道，符合血清学特点的ABO亚型，基因检测结果与之不符ABO血型亚型与突变基因关系血清学检测易受主客观因素的影响，28ABO血型基因的临床应用解决出现血型表型分型困难与出现的输血等困难血型基因分型的优点：——不受检材限制，各种有核细胞如毛囊、组织块、血痕、羊水等都可作为检材而不必考虑表达问题,——不受血清中自身抗体、不规则抗体的影响——不受疾病的影响，某些疾病如肿瘤、白血病等引起的血型抗原表达异常所致的血型“转变”可直接定基因型——可快速解决血型鉴定中的假凝集、弱凝集(如细菌污染、血浆蛋白紊乱等所致)现象ABO血型基因的临床应用解决出现血型表型分型困难与出现的输血29ABO血型基因的临床应用新生儿与胎儿溶血病产前诊断——早期鉴定胎母血型不合有助于实施干预治疗——早期产前诊断标本主要为羊水细胞，羊水细胞多为死亡的细胞，ＤＮＡ存在不同程度的降解，基因检测要求内参对照以确保结果准确——母体血浆获得胎儿的ＤＮＡ样本，应注意评估可能出现的母体ＤＮＡ的污染问题，检测母体血浆和细胞的ＳＴＲ位点以保证结果的准确性ABO血型基因的临床应用新生儿与胎儿溶血病产前诊断30ABO血型基因的临床应用作为个体特异性的遗传标志物——用于ＡＢＯ血型不合造血干细胞移植后嵌合体监测，指导ＡＢＯ血型不合移植后临床输血支持治疗——家系遗传学分析ABO血型基因的临床应用作为个体特异性的遗传标志物31ABO血型基因检测技术核心技术：聚合酶链反应PCR-RFLPPCR-SSPDNA序列测定ABO血型基因检测技术核心技术：聚合酶链反应32PCR－RFLP原理：——PCR扩增出包含突变位点的特定片段——利用突变位点特异的限制性内切酶消化ABO基因扩增产物——特定的片段经凝胶电泳检测便能获得ＳＮＰ的特征——以ＳＮＰ组合的方式鉴定ＡＢＯ基因型。PCR－RFLP原理：33PCR－SSP目前最常用的基因分型技术，PCR扩增产物通过凝胶电泳进行分析。根据基因座特异的SNP特征设计相应的序列特异性引物PCR扩增产物的有无是鉴定特异性等位基因的基础本法也存在一定假阳性率，有学者选择在SSP的３′末端即SNP位置的倒数第２或第３个位置上设计错配以提高引物的扩增特异性。注意选用不具外切酶活性的TaqDNA聚合酶，否则容易出现假阳性扩增。目前有单管扩增的PCR检测模式，也有多重PCR同管扩增的模式PCR－SSP目前最常用的基因分型技术，PCR扩增产物通过34PCR—SSPPCR—SSP35ABO基因测序通过PCR扩增基因的主要片断，对产物进行序列分析，对照标准基因片断，分析基因突变的碱基以确定血型结果准确可靠需要特殊的仪器设备操作复杂，成本高ABO基因测序通过PCR扩增基因的主要片断，对产物进行序列分36一个带有B(A)700C>G突变的B(A)02家系700G700C703A/G703AB(A)02(700C>G)B/Oindividuals一个带有B(A)700C>G突变的B(A)02家系700G37nt640nt641NormalB101alleleB(A)640A>GalleleGenbankaccession:DQ124679B(A)641T>CalleleGenbankaccession:DQ124678nt640nt641NormalB101alleleB38

血清学方法与DNA技术相互补充