细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南

细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南TechnicalGuidelinesonBiofilmCultivation,ExaminationandResistanceEvaluation1适用范围

本指南规定了细菌生物被膜培养、观测和耐药性评测技术的实验条件要求、实验设计、实施与验证等技术要求。本指南可作为实验室细菌生物被膜培养与构建、观测与定量、以及耐药性评估等工作的技术依据。根据《中华人民共和国专利法》，对于本指南中所涉及专利技术（US9988380B2，US10416153B2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需获得专利权所有人书面许可。2术语和定义2.1

生物被膜：指细菌粘附于生物或非生物基质表面，分泌胞外多糖、蛋白质、胞外DNA等，将细菌细胞保护于其中而形成的膜状细菌群落。2.2交叉感染：细菌或其他微生物从一种物质或物体转移到另一种物质或物体并产生有害影响的过程。2.3ColonyFormingUnit(CFU):菌落形成单位，是一种活细菌细胞数量的测量方法，以CFU/mL为单位。2.4群体感应：指一种细菌细胞间的信号转导系统，群体感应在多种致病菌中控制毒力因子的合成。3细菌生物被膜培养方法与技术标准以下生物被膜培养方法与技术标准均以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种培养以及实验条件可按需求适当调整。3.1体外生物被膜培养(invitrostaticbiofilm)3.1.1体外静态生物被膜培养方法-孔板培养法准备以下材料：无菌96孔板（或24孔板,Nest/Corning）；无菌储液器；100uL排枪移液器（或1mL移液器）；15mL无菌摇菌管；100uL（或1mL）移液器枪头；LB培养基（可按需使用其他培养基）；所需菌株；废液桶；75%酒精；无菌ddH2O；无菌生理盐水；培养步骤如下：首先将LB培养基和移液器枪头在121℃高温高压灭菌15-30分钟，取出并将枪头干燥备用。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基（例：如所需菌量不多，可接种2mL；所需菌量须以最终所需菌液体积计算）中，按所需温度（例：铜绿假单胞菌需37℃或丁香假单胞菌需30℃等）200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜培养基将菌液稀释至OD600nm=0.01-0.05，将稀释好的菌液倾倒入无菌储液器，用排枪移液器将100uL稀释菌液加入96孔板孔洞中（或1mL移液器将1mL稀释菌液加入24孔板孔洞中），每株菌至少三个重复。将加入菌液的孔板在所需温度下静置培养至少16小时，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150μLddH2O（结晶紫染色）或无菌生理盐水（死活菌荧光染色）洗两次，移除所有液体，生物被膜生长于孔壁上。孔板培养法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发；移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可用枪头触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。3.1.2体外动态生物被膜培养方法-玻璃珠培养法准备以下材料：无菌24孔板；无菌储液器；1mL移液器15mL无菌摇菌管；1mL移液器枪头；LB培养基（可按需使用其他培养基）；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；所需菌株；废液桶；75%酒精；镊子；3-5mm玻璃珠；培养步骤如下：首先将LB培养基、移液器枪头、镊子和玻璃珠在121℃高温高压灭菌15分钟，取出并将枪头、镊子与玻璃珠干燥备用。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基中，在所需温度下200rpm震荡培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600nm=0.01-0.05。用无菌镊子将两枚玻璃珠转移至同一个24孔板孔洞内，将菌液倾倒入储液器内，在每个孔洞中加入1mL稀释菌液，每株菌至少三个重复。将加入菌液与玻璃珠的孔板在所需温度下，100rpm转速摇晃培养至少16小时，以形成生物被膜。生物被膜在玻璃珠表面形成后，准备新的24孔板，在孔洞内加入1mLddH2O，用无菌镊子小心将玻璃珠移入备有ddH2O的24孔板孔洞内，慢摇一分钟清洗，重复此清洗步骤两次，将玻璃珠取出置入新的24孔板中，生物被膜附着于玻璃珠表面。玻璃珠培养法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用移液器反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；孔洞内菌液不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成交叉污染；用无菌镊子转移玻璃珠时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发；3.1.3体外静态/动态生物被膜培养方法-玻片培养法准备以下材料：无菌培养皿（静置培养需准备6孔板）；15mL无菌摇菌管；LB培养基（可按需使用其他培养基）；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）所需菌株；废液桶；75%酒精；镊子；载玻片；培养步骤如下：首先将LB培养基、移液器枪头、镊子和载玻片在121℃高温高压灭菌15分钟，取出并将枪头、镊子与载玻片干燥备用。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基中，在所需温度下200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600nm=0.01，将无菌载玻片置入培养皿底部，将稀释菌液倾倒入培养皿，将载玻片于所需温度下，100rmp摇晃培养至少16小时，以形成生物被膜（如需静置培养，可将玻片斜插入孔板中，静置培养16小时以上，形成生物被膜）。生物被膜形成后，用无菌镊子小心将载玻片转移至新的培养皿中，用1mLddH2O冲洗载玻片至少3次，移除所有废液，重复清洗步骤两次。将载玻片转移至新的培养皿中，生物被膜附着于载玻片表面。玻片培养法技术标准:所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；培养皿内菌液不可过多，以免摇晃培养时菌液溅出造成污染；用无菌镊子转移载玻片时，需尽量减少镊子与玻璃珠接触面，以保证生物被膜完整性；摇晃培养时需用透气封口膜密封培养皿防止液体蒸发。3.1.4体外动态生物被膜培养方法-Peglid培养法准备以下材料：96孔板；Peglid盖子（见附录图三）;无菌储液器；100uL排枪移液器；15mL无菌摇菌管；100uL（或1mL）移液器枪头；LB培养基（可按需使用其他培养基）；所需菌株；废液桶；75%酒精；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；无菌生理盐水；培养步骤如下：首先将LB培养基和移液器枪头在121℃高温高压灭菌15-30分钟，取出并将枪头干燥备用。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基（例：如所需菌量不多，可接种2mL；所需菌量须以最终所需菌液体积计算）中，按所需温度（例：铜绿假单胞菌需37℃或丁香假单胞菌需30℃等）200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜培养基将菌液稀释至OD600nm=0.01-0.05，将稀释好的菌液倾倒入无菌储液器，用排枪移液器将100uL稀释菌液加入96孔板孔洞中，每株菌至少三个重复，将peglid小心盖入菌液中，将孔板在所需温度下100rpm震荡培养至少16小时，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150uLddH2O洗两次，移除所有液体，生物被膜生长于peglid中下端。Peglid培养法技术标准:所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染；在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差；孔洞内菌液不可过多，以免置入peglid或震荡培养时菌液溅出造成污染；需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发；移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。3.2体外流式生物被膜培养3.2.1体外流式生物被膜培养方法-管式培养法（tubing-biofilm）准备以下材料：15mL无菌摇菌管；长50cm，内直径1.0mm硅胶管（润泽）；长25cm，内直径1.0mm硅胶泵管（润泽），双端安装等径直通接头；长15cm，内直径1.0mm硅胶管（润泽）；长10cm，内直径3.2mm硅胶管（润泽）；双端安装等径直通接头；长30cm，内直径1.0mm硅胶泵管（润泽）；2个2L玻璃培养瓶；10%LB培养基（可按需使用其他培养基）；过滤器（过滤孔0.22μm）；无阻泵（aperistalticpump，MasterFlex）；所需菌株；医用尖锐物处理容器；75%酒精；镊子；5mL无菌针管；无菌针头；移液器；无菌移液管；管式培养系统搭建：首先将装有培养基的玻璃培养瓶、硅胶管、除泡器和镊子在121℃高温高压灭菌15分钟，取出并将硅胶管、除泡器和镊子干燥备用。如图一所示，在无菌操作台中按顺序用安装双向接头的硅胶管b连接装有培养基的玻璃培养瓶、无阻泵、过滤器、硅胶管c,d,e,f，2L废液罐，同个装置内至少三个平行（图内展示一个平行），将整个系统置于恒温培养箱内。图一.管式培养法示意图。培养步骤如下：将目标菌株接种至适当体积的LB培养基中，在所需温度下200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600nm=0.1，用无菌针管吸入2mL稀释菌液，并将稀释菌液分别注入硅胶管b平行装置中，用硅胶封口后静置培养2小时使细菌细胞粘附于管壁,用10%LB流动培养基培养3至7天，建立生物被膜。管式培养法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作人员；将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员；保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；保证硅胶管管壁厚度适宜，造成管壁破裂，影响生物被膜形成；在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒瓶口与邻近装置表面，避免污染；培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发；3.2.2体外流式生物被膜培养方法-池式培养法（flow-cellbiofilm）准备以下材料：15mL无菌摇菌管；三通道培养池（3-channelflow-cell）与树脂盖；长50cm，内直径1.0mm硅胶管；长25cm，内直径1.0mm硅胶泵管，双端安装等径直通接头；长15cm，内直径1.0mm硅胶管；长30cm，内直径1.0mm硅胶泵管；2个2L玻璃培养瓶；10%LB培养基（可按需使用其他培养基）；过滤器（过滤孔0.22μm）；无阻泵（aperistalticpump）；所需菌株；医用尖锐物处理容器；75%酒精；镊子；5mL无菌针管；无菌针头；移液器；无菌移液管；池式培养系统搭建：首先将三通道培养池与盖子紧密黏结晾干。将装有培养基的玻璃培养瓶、三通道培养池、硅胶管、除泡器和镊子在121℃高温高压灭菌15分钟，取出并将培养池、硅胶管、除泡器和镊子干燥备用。如图二所示，在无菌操作台中按顺序用安装双向接头的硅胶管c连接装有培养基的玻璃培养瓶、无阻泵、过滤器、培养池（三个平行），硅胶管c,d,e,f，2L废液罐，将整个系统置于恒温培养箱内。图二.池式培养系统示意图。培养步骤如下：将目标菌株接种至LB培养基中，在所需温度下200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜LB培养基将菌液稀释至OD600nm=0.1，用无菌针管吸入1mL稀释菌液，将600µL稀释菌液分别从培养池前硅胶管约1cm处注入培养池三个通道内，用硅胶封口后翻转静置培养2小时使细菌细胞粘附于树脂池盖,用10%LB流动培养基培养3至7天，建立生物被膜。池式培养法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;使用针管与针头吸取菌液后，针头不可朝向操作人，不可盖回针头盖子，以免误伤操作人员；将使用过的针管与针头丢弃入医用尖锐物处理容器统一处理，避免误伤操作人员；保证无阻泵运行速度一致，避免液体回流造成污染；保证培养池翻转状态，以免影响生物被膜形成；黏结培养池与池盖时须小心不可将池盖压破，并须保证培养池与池盖完全密封，避免菌液与培养基溢出造成污染；保证培养池所有通道畅通，避免堵塞造成液体回流与污染；在培养过程中如需添加培养基，须用酒精消毒瓶口与邻近装置表面，避免污染；培养瓶口须用透气封口膜密封防止培养基蒸发。细菌生物被膜定量与观测技术与标准4.1生物被膜定量技术与标准4.1.1生物被膜定量技术-结晶紫染色法结晶紫染色法适用于孔板培养、玻璃珠培养、玻片培养和Peglid培养的生物被膜。准备以下材料：孔板培养、玻璃珠培养或玻片的生物被膜样本（参考3.1.1、3.1.2、3.1.3和3.1.4培养方法）；1%结晶紫溶液；ddH2O；30%冰醋酸；96孔板；24孔板；100µL排枪移液器（或1mL移液器）；100µL（或1mL）移液器枪头；镊子；废液罐；操作流程：孔板培养的生物被膜：在每个附着有生物被膜的96孔板孔洞中加入125µL的1%结晶紫溶液（24孔板孔洞中加入1.25mL），室温静置15-30分钟染色。染色后，移除结晶紫溶液，用ddH2O彻底冲洗多余的结晶紫溶液，室温风干。在每个孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，100rpm室温慢摇3分钟溶解结晶紫。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm测量结晶紫染色吸光度来相对定量生物膜形成。玻璃珠培养的生物被膜：在每个24孔板孔洞中加入1mL的1%结晶紫溶液，将附着生物被膜的玻璃珠置入孔洞内，室温静置15-30分钟染色。染色后，移除结晶紫溶液，准备新的24孔板，在每个孔洞中加入1.25mLddH2O，将染色后的玻璃珠置入新的24孔板孔洞中，慢摇清洗多余的结晶紫溶液，重复清洗步骤三次，将玻璃珠移入新的24孔板孔洞中室温风干。在每个孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，100rpm室温慢摇3分钟溶解结晶紫，移除玻璃珠。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm测量结晶紫染色吸光度来相对定量生物膜形成。玻片培养的生物被膜：将动态培养的玻片生物被膜置于培养皿底部，将1%结晶紫溶液滴在生物被膜表面，保证完全覆盖生物被膜（静态培养的玻片生物被膜可斜置于盛有1%结晶紫溶液的6孔板孔洞内，保证结晶紫溶液完全没过生物被膜），室温静置15-30分钟染色。染色后，取出玻片，用2mLddH2O重复冲洗玻片至少步骤三次，洗除多余结晶紫溶液。将玻片室温风干，在6孔板每个孔洞中加入1mL的30%冰醋酸，将染色后的生物被膜浸入冰醋酸中溶解，吸取冰醋酸轻轻吹打溶解未浸入的生物被膜。用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm测量结晶紫染色吸光度来相对定量生物膜形成。Peglid培养的生物被膜：在96孔板孔洞中加入125uL的1%结晶紫溶液，将附着有生物被膜的peglid小心置入96孔板内，室温静置15-30分钟染色。染色后，将peglid转移至含有125uLddH2O的新96孔板内，100rpm慢摇清洗3分钟，重复清洗步骤三次去除多余的结晶紫溶液，将peglid室温风干。取新的96孔板，在每个孔洞中加入125uL的30%冰醋酸，将peglid置入孔板内，100rpm室温慢摇3分钟溶解结晶紫。取出peglid，盖好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD550nm测量结晶紫染色吸光度来相对定量生物膜形成。结晶紫染色法技术要点：所有操作须严格遵守标准操作流程，在操作醋酸过程中，需严格遵守标准操作流程，避免误伤操作人员;染色过程中，结晶紫溶液体积须覆盖全部生物被膜生长区域，减少误差；染色后，须彻底冲洗悬浮的结晶紫溶液，减少误差；移液过程中，须注意不可用移液器枪头直接触碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；结晶紫溶液废液与醋酸溶液废液须分别倾倒至指定废液罐内另行处理，不可随意倾倒或按照普通液体处理；4.1.2生物被膜定量技术-死活菌细胞（Syto9/PI）染色法此方法适用于孔板培养、玻片培养和流式培养的生物被膜。此方法可染色定量生物被膜内的活菌细胞和死菌细胞。准备以下材料：孔板培养、玻片培养和流式培养的生物被膜样本（参考3.1.1、3.1.3和3.2培养方法）；96孔板；培养皿；100uL移液器（或1mL移液器）；100uL（或1mL）移液器枪头；注射器及注射针头；镊子；废液罐；活死细胞染色试剂盒（L7012,Thermofisher,USA）或Syto9/PI染色剂（S34854,P3566,Thermofiser,USA）0.85%氯化钠溶液操作流程：孔板培养的生物被膜：将每个附着有生物被膜的96孔板孔洞冲洗后，加入125μLSyto9/PI染色剂（工作浓度为3.34μM/20mM)室温静置避光染色15分钟。用荧光显微镜观察生物被膜形态并相对定量。玻片培养的生物被膜：将附着有生物被膜的玻片置于培养皿中，加入适量Syto9/PI染色剂（工作浓度为3.34μM/20mM)，以覆盖住生物被膜生长区域为宜，室温静置15分钟染色。用荧光显微镜观察生物被膜形态并相对定量。池式培养的生物被膜：用燕尾夹将附着有生物被膜的培养池流入端和流出端的硅胶管固定后，将培养池从培养系统中小心取出，置于水平台面上。将流出端燕尾夹移除，用注射器将0.5mLSyto9/PI染色剂（工作浓度为3.34μM/20mM)缓慢地从流入端注射进入培养池中，注射完毕后将流出端用燕尾夹固定。室温静置避光染色15分钟染色。用荧光显微镜观察生物被膜形态并相对定量。Syto9/PI染色法技术要点：用荧光显微镜观察生物被膜需要使用共聚焦培养皿类的平板，例如8-wellμ-slides(80826，ibidi)所有操作须严格遵守标准操作流程，在操作染色剂过程中，需严格遵守标准操作流程，避免误伤操作人员;染色过程中，染色液体积须覆盖全部生物被膜生长区域，减少误差；移液过程中，须注意不可用移液器枪头直接触碰生物被膜，以保持生物被膜完整性；染色完成后，应避免剧烈震荡，并须注意在三小时内进行荧光显微镜观察，以免生物被膜结构收到损伤而造成误差；染色液废液须倾倒至指定废液罐内另行处理，不可随意倾倒或按照普通液体处理；4.1.3生物被膜定量技术-CFU计数法此方法适用于孔板培养、玻璃珠培养、玻片培养和管式培养的生物被膜。此方法可检测生物被膜中存活的细菌数量。准备以下材料：孔板培养、玻璃珠培养、玻片培养、peglid培养和管式培养的生物被膜样本（参考3.1.1、3.1.2、3.1.3、3.1.4和3.2.1培养方法）；24孔板；无菌培养皿；无菌刮刀；2mL和10mL无菌离心管；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；LB琼脂平板（或按菌株需要，准备其他培养基琼脂平板）100µL移液器和1mL移液器；100µL和1mL移液器枪头；10mL无菌针管；镊子；废液罐；超声水浴仪（Elma,ElmasonicP120H）；操作流程：孔板培养的生物被膜：在无菌操作台中，将附着有生物被膜的孔板孔洞内加入150µLddH2O（如用24孔板，则加入1.25mLddH2O）清洗两次去除悬浮细菌，移除所有上清液，再加入100uLddH2O（如用24孔板，则加入1mLddH2O）。将孔板用透气封口膜密封，用超声水浴仪，在37kHz，100%power，震荡10分钟。在水浴仪内加冰以防止温度过高。超声后，将孔洞内菌液以10倍连续稀释至10-7，从10-4至10-7稀释液中取100µL涂布在LB琼脂平板上，至少三个重复，将涂好的平板在无菌操作台中晾干表面，在所需温度下将涂有菌液的平板静置培养至少16小时，取出平板计算菌落数量以定量孔板生物被膜中的细菌量。玻璃珠培养的生物被膜：在无菌操作台中，将附着有生物被膜的玻璃珠置于24孔板空洞内，每孔两个珠子。加入1.5mLddH2O清洗两次去除悬浮细菌。用超声水浴仪，在37kHz，100%power，震荡10分钟。在水浴仪内加冰以防止温度过高。超声后，将玻璃珠小心移除，把孔洞内的菌液转移至2mL离心管内，5000rpm室温离心5分钟，移除上清液并将细菌重悬在1mLddH2O中。以10倍连续稀释至10-7，从10-4至10-7稀释液中取100uL涂布在LB琼脂平板上，至少三个重复，将涂好的平板在无菌操作台中晾干表面，在所需温度下将涂有菌液的平板静置培养至少16小时，取出平板计算菌落数量以定量玻璃珠生物被膜中的细菌量。玻片培养的生物被膜:在无菌操作台中，将附着有生物被膜的玻片置于无菌培养皿内，用无菌刮刀将附着在玻片上的的生物被膜轻轻刮下，转置于2mL无菌离心管内，加入1mLddH2O并用移液枪反复吹打生物被膜细菌。用超声水浴仪，在37kHz，100%power，震荡10分钟。在水浴仪内加冰以防止温度过高。超声后，5000rpm室温离心5分钟，移除上清液并将细菌重悬在1mLddH2O中。以10倍连续稀释至10-7，从10-4至10-7稀释液中取100µL涂布在LB琼脂平板上，至少三个重复，将涂好的平板在无菌操作台中晾干表面，在所需温度下将涂有菌液的平板静置培养至少16小时，取出平板计算菌落数量以定量玻片生物被膜中的细菌量。Peglid培养的生物被膜：在无菌操作台中，将附着有生物被膜的peglid置入含有125uLddH2O的96孔板内，100rpm慢摇清洗两次去除悬浮细菌。将peglid转移至新的含有100uLddH2O的96孔板内，将孔板用透气封口膜密封，用超声水浴仪，在37kHz，100%power，震荡10分钟。在水浴仪内加冰以防止温度过高。超声后，移出peglid，将孔洞内菌液以10倍连续稀释至10-7，从10-4至10-7稀释液中取100uL涂布在LB琼脂平板上，至少三个重复，将涂好的平板在无菌操作台中晾干表面，在所需温度下将涂有菌液的平板静置培养至少16小时，取出平板计算菌落数量以定量孔板生物被膜中的细菌量。管式培养的生物被膜：将附着有生物被膜的硅胶管从培养系统中小心取出。在无菌操作台中，用两支10mL无菌针管，分别吸入2.5mLddH2O，将针管分别小心插入硅胶管两端，从一侧慢慢将ddH2O注入硅胶管内，将生物被膜推入另一侧针管内，两侧交替重复此步骤数次至完全洗脱生物被膜。将洗脱的生物被膜转移至10mL离心管内，5000rpm室温离心3分钟并移除上清液，用2mLddH2O清洗两次生物被膜并重新悬浮在1毫升ddH2O内，用超声水浴仪，在37kHz，100%power，震荡10分钟。在水浴仪内加冰以防止温度过高。超声后，将菌液以10倍连续稀释至10-7，从10-4至10-7稀释液中取100uL涂布在LB琼脂平板上，至少三个重复。将涂好的平板在无菌操作台中晾干表面，在所需温度下将涂有菌液的平板静置培养至少16小时，取出平板计算菌落数量以定量管式生物被膜中的细菌量。CFU计数法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;所有超声破碎步骤须在冰上操作或在仪器中加入碎冰以保持低温，避免温度过高影响细菌活性；此处使用的超声水浴条件只限于CFU计数法使用，如后续需进行其他步骤，超声条件须按需调整；涂布稀释菌液须选择多个稀释浓度，静置培养后选择菌落数量在30-300个的稀释浓度作为计数浓度，避免菌落数量过低或过高导致误差；涂布好的平板在培养前须晾干表面，并在培养过程中倒置与培养箱内，避免生成水珠滴在平板表面，影响计数结果；如细菌须36小时以上的培养时间，须用透气封口膜密封平板，防止琼脂蒸发造成干裂影响计数结果。4.1.4生物被膜定量技术-干重/湿重定量法此方法适用于玻片培养和管式培养的生物被膜。此方法可计算生物被膜内所有物质总重量，包括细菌、胞外多糖等。准备以下材料：玻片培养和管式培养的生物被膜样本（参考3.1.3和3.2.1培养方法）；无菌培养皿；无菌刮刀；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；2mL和10mL无菌离心管；100µL移液器和1mL移液器；100µL和1mL移液器枪头；10mL无菌针管；废液罐；SpeedVac恒温干燥仪；操作流程：玻片培养的生物被膜:先将准备好的2mL无菌离心管称重并记录。在无菌操作台中，将附着有生物被膜的玻片置于无菌培养皿内，用无菌刮刀将附着在玻片上的的生物被膜轻轻刮下，转置于2mL无菌离心管内，将生物被膜样品在5000rpm室温状态下离心3分钟，移除所有上清液。将离心管外壁擦拭干净并晾干后称重，用总重量减去离心管重量可得到生物被膜湿重。（若需生物被膜干重，将生物被膜离心并移除上清液后，在SpeedVac恒温状态下将生物被膜彻底干燥后称重定量，干燥温度可按实验需求设定，如需低温4℃或室温25℃等）管式培养的生物被膜：先将准备好的10mL无菌离心管称重并记录。在无菌操作台中，将附着有生物被膜的硅胶管从培养系统中小心取出，用两支10mL无菌针管，分别吸入2.5mLddH2O，将针管分别小心插入硅胶管两端，从一侧慢慢将ddH2O注入硅胶管内，将生物被膜推入另一侧针管内，两侧交替重复此步骤数次至完全洗脱生物被膜。将洗脱的生物被膜转移至10mL离心管内，5000rpm室温离心3分钟并移除上清液，将离心管外壁擦拭干净并晾干后称重，用总重量减去离心管重量可得到生物被膜湿重。（若需生物被膜干重，将生物被膜离心并移除上清液后，在SpeedVac恒温状态下将生物被膜彻底干燥后称重定量，干燥温度可按实验需求设定，如需低温4℃或室温25℃等）干重/湿重定量法技术要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;如需测生物被膜湿重，须尽量移除所有上清液，以避免上清液遗留太多影响称重结果或造成误差过大；如需测量生物被膜湿重，并进行后续实验，所有操作步骤温度需要严格按照实验需求设定，避免影响后续分析；如需测量生物被膜干重，并进行后续实验，所有操作步骤以及干燥温度须严格按照实验需求设定，避免影响后续分析；离心后，须将离心管外壁的水汽彻底干燥后再称重，避免凝结的水汽影响称重结果或造成误差过大。4.1.5生物被膜定量技术-3D成像COMSTAT/IMARIS定量法此方法适用于激光共聚焦荧光显微镜拍摄的生物被膜。准备以下材料：激光共聚焦荧光显微镜拍摄的3D生物被膜图像（参考4.2.1观测方法）；操作流程：Comstat2定量分析：用ImageJ软件打开激光共聚焦荧光显微镜图像，将原始文件格式转为OME-Tiff格式，并将同一分组的所有OME-Tiff文件存在同一个子文件夹内；打开Comstat2分析软件，将文件夹路径指定为保存好的子文件夹，导入该分组的所有OME-Tiff图像文件；设置threshold，计算Biomass,surfacecoverage,thickness等生物被膜形态相关的关键参数。Imaris定量分析：打开Imaris软件进入Arena功能区，将要分析的图像文件所在的文件夹导入Arena功能区，选择其中一个图像，调整threshold并保存参数，回到Arena功能区，用保存的参数进行batchprocessing。3D成像COMSTAT/IMARIS定量法技术要点使用batchprocessing之前，threshold要逐一查看，以免引起计算误差调整完参数的文件需要另存为副本，以免造成原始文件覆盖使得信息丢失4.2生物被膜观测技术与标准4.2.1生物被膜观测技术-激光共聚焦荧光显微镜观察法此方法适用于荧光染色或荧光标记的玻片培养及池式培养的生物被膜。准备以下材料：玻片培养以及池式培养的具有荧光蛋白标记的生物被膜样本（参考3.1.3和3.2.2培养方法），或荧光染色的玻片培养以及池式培养的生物被膜样本（参考4.1.2染色方法）操作流程：将生物被膜样本置于激光共聚焦荧光显微镜的载物台上，通过光学目镜找到合适的视野和焦点；选择荧光蛋白/荧光染色剂匹配的激光源和滤波片参数，调整激光源强度和信号放大器强度，找到高信噪比的参数集；确定拍摄的最低表面和最高表面，设置最佳z-轴拍摄间距，进行z-stack扫描拍摄，并收集图像信息。共聚焦显微镜技术标准：为保证统计数据有效性和可重复性，每个样品须通过随机采样法对生物被膜培养区域拍摄不少于5个视野的生物被膜。观测前生物被膜须以进行荧光染色，如不经染色，则须使用携带荧光标记的细菌菌株；荧光染色剂/荧光蛋白标记的荧光信号，须跟所用的激光共聚焦荧光显微镜的激光通道相匹配，且进行多荧光通道染色/标记时须避免激发光/吸收光相近的通道，以免造成误差；在使用激光共聚焦荧光显微镜时，应避免载物台震动引起的误差；在使用激光共聚焦荧光显微镜时，应适当调整激光源能量，较高的能量容易引发荧光信号猝灭，造成误差。如需使用荧光探针观测生物膜，具体参考专利（US10416153B2）。4.2.2生物被膜观测技术-电子显微镜（SEM）此方法适用于流式培养的生物被膜。准备以下材料：管式培养的生物被膜样本（参考3.2.1培养方法）；玻片培养生物被膜样本（参考3.1.3培养方法）操作流程：管式培养的生物被膜：从管式生物被膜系统中将附着有生物被膜的硅胶管小心取出。将附着有生物被膜的培养管用无菌切刀切成0.5mm大小.2.5%戊二醛，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥，并按标准步骤溅射涂金。玻片培养的生物被膜：将载有生物被膜的玻片小心取出，2.5%戊二醛，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥，将玻片切成0.5mm大小，并按标准步骤溅射涂金。电子显微镜技术标准：观测前生物被膜须以2.5%戊二醛室温固定1h后，放置于4℃冰箱保存（不要超过1周）；乙醇梯度脱水。样品先用蒸馏水清洗三次，每次7min，然后依次用50%、70%、85%及95%、100%的乙醇分别处理12min，最后再用无水乙醇处理三次，每次15min。CO2临界点干燥及喷金操作，按仪器使用说明进行即可。细菌生物被膜耐药性检测方法与评定标准5.1细菌生物被膜耐药性检测方法-最小抑菌浓度法此方法适用于孔板培养以及玻璃珠培养的生物被膜。准备以下材料：孔板培养、玻璃珠培养和peglid培养的生物被膜（参考3.1.1、3.1.2和3.1.4培养方法）；所需抗生素（或其他抑菌化合物）；100µL排枪移液器；100µL移液器枪头；96孔板、24孔板；无菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理盐水）；无菌LB培养基（或按菌株所需其他培养基）；LB琼脂板；废液桶；操作流程：孔板培养的生物被膜：在无菌操作台中，用适当体积的LB培养基将所需抗生素溶解至起始浓度为100µµg/mL（可按需调整起始浓度），用0.2µm过滤膜过滤后，2倍连续稀释得到适当体积的50µµg/mL，25µµg/mL，12.5µµg/mL，6.25µµg/mL，3.125µµg/mL，1.562µµg/mL和0µµg/mL（仅培养基）。移除孔板生物被膜中全部上清液，用ddH2O清洗两次，移除所有废液。将100uL体积（24孔板生物被膜取1mL）的100µµg/mL至0µµg/mL全部稀释浓度的抗生素溶液分别添加至孔洞中，每浓度至少3个重复，在菌株生长所需温度下静置培养16-24小时（可根据菌株生长或实验目的适当调整培养时间）。取出孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm测量孔洞中菌液浓度，OD650nm<0.1代表细菌生长被抑制。移除孔洞内菌液，将孔洞中生物被膜用ddH2O清洗两次，洗脱悬浮细菌。之后，按4.1.3a部分CFU计数法操作方法，定量抗生素处理后的生物被膜细菌CFU数量，计算抗生素最小抑菌浓度。玻璃珠培养的生物被膜：在无菌操作台中，用适当体积的LB培养基将所需抗生素溶解至起始浓度为100µµg/mL（可按需调整起始浓度），用0.2µm过滤膜过滤后，2倍连续稀释得到适当体积的50µµg/mL，25µµg/mL，12.5µµg/mL，6.25µµg/mL，3.125µµg/mL，1.562µµg/mL和0µµg/mL（仅培养基）。将附着有生物被膜的玻璃珠转移至新的24孔板中，用ddH2O清洗两次后转移至新的24孔板。将1mL的100µµg/mL至0µµg/mL全部稀释浓度的抗生素溶液分别添加至孔洞中，每浓度至少3个重复，在菌株生长所需温度下以100rpm转速慢摇培养16-24小时（可根据菌株生长或实验目的适当调整培养时间）。取出孔板并将玻璃珠转移至新的24孔板内，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm测量孔洞中菌液浓度，OD650nm<0.1代表细菌生长被抑制。之后，将玻璃珠用ddH2O清洗两次，洗脱悬浮细菌。之后，按4.1.3b部分CFU计数法操作方法，定量抗生素处理后的生物被膜细菌CFU数量，计算抗生素最小抑菌浓度。Peglid培养的生物被膜：在无菌操作台中，用适当体积的LB培养基将所需抗生素溶解至起始浓度为100µµg/mL（可按需调整起始浓度），用0.2µm过滤膜过滤后，2倍连续稀释得到适当体积的50µµg/mL，25µµg/mL，12.5µµg/mL，6.25µµg/mL，3.125µµg/mL，1.562µµg/mL和0µµg/mL（仅培养基），将100µL体积的100µµg/mL至0µµg/mL全部稀释浓度的抗生素溶液分别添加至孔洞中，每浓度至少3个重复，将附着有生物被膜的peglid小心置入抗生素溶液中，在菌株生长所需温度下静置培养16-24小时（可根据菌株生长或实验目的适当调整培养时间）。取出peglid，盖好96孔板，用Tecaninfinitypro200microplatereader在OD650nm测量孔洞中菌液浓度，OD650nm<0.1代表细菌生长被抑制。同时，将peglid生物被膜用ddH2O清洗两次，洗脱悬浮细菌。之后，按4.1.3d部分CFU计数法操作方法，定量抗生素处理后的生物被膜细菌CFU数量，计算抗生素最小抑菌浓度。最小抑菌浓度法评定要点：所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染;抗生素需按照特性溶解于不同溶液中：如四环素溶于乙醇中，仅微溶于水等；后稀释于所需培养基；悬浮细菌须彻底清洗，以免影响最终评测结果；抗生素起始浓度和加入抗生素后培养时间须按抗生素特性如时间依赖性或浓度依赖性进行适当调整；最小抑菌浓度须按抑制99.9%的细菌生长为测定标准；生物被膜耐药程度可以NCCLS/CLSI药敏试验标准中的MIC值做参考标准;如需使用群体感应抑制剂（Qu