食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型分布研究

PAGEPAGE1食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型分布研究沈玄艺*宋启发徐景野朱国良章丹阳（浙江省宁波市疾病预防控制中心浙江宁波315010）摘要：目的采用PCR法扩增食源性金黄色葡萄球菌中肠毒素基因以了解该菌肠毒素基因携带情况，比较食物中毒和食品监测来源菌株中肠毒素检出差异。方法合成sea、seb、sec、sed和see五种肠毒素基因特异性引物，用常规PCR方法扩增食物中毒和食品监测来源菌株中各自肠毒素基因。结果110株菌株中有30株检出肠毒素基因，检出率为27.3%，所有肠毒素基因阳性菌株只存在一种肠毒素基因，其中14株来自两起食物中毒，为seb型肠毒素基因，检出率为100%。来源于食品监测样本的96株菌株中有16株检出肠毒素，检出率为14.5%，其中sea型4株、seb型2株、sec型4株、sed型6株。结论在宁波市金黄色葡萄球菌肠毒素所致食物中毒主要由seb型肠毒素引起，食品监测菌株中肠毒素检出率较高。关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；基因StudyofenterotoxingenotypesinfoodbornestaphylococcusaureusisolatesSHENXuan-yi,SONGQi-fa,XUJing-ye,ZHUGuo-liang，ZHANGDan-yang（NingboCenterforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315010，China）Abstract：ObjectiveTostudyandcomparethecarryingstatusofenterotoxininfoodbornestaphylococcusaureusisolatesfromfood-poisoningandfoodinspectionsources.MethodsFivetypesofenterotoxinsinisolatesfromfood-poisoningandfoodinspectionsourcesweredetectedwithfivekindsofprimersofsea,seb,sec,sedandsee.ResultsThirtysampleswerefoundenterotoxinpositivein110samples(27.3%,30/110)andonlyonetypeofenterotoxinexistedinallpositivesamples.Enterotoxinofsebwasamplifiedinfourteenisolatesfromtwofood-poisoningoutbreaks(100%,14/14).Sixteensamplesfromfoodinspectionsourceswereenterotoxinpositive,whichconsistedofenterotoxinsofsea(4),seb(2),sec(4)andsed(6).ConclusionsEnterotoxinofsebisthemajorfactoroffood-poisoningcausedbystaphylococcusaureus.Detectionofenterotoxinsshouldbestrengthenedforthehighdetectionrateofenterotoxinsinisolatesofstaphylococcusaureus.作者简介：沈玄艺(1979～)，女，浙江宁波人，主管技师，主要从事卫生微生物检验工作*通信作者：宋启发(1969～)，男，浙江宁波人，副主任技师，研究方向：细菌基因组学，Email：songqf@Keywords：staphylococcusaureus;enterotoxin;genePTSAgs：familyofbacterialpyrogenictoxinsuperantigens1材料与方法1.1菌株：110株金黄色葡萄球菌来源为食物中毒和食品监测样品，SCDLP增菌后用金黄色葡萄球菌显色平板分离培养后按常规方法鉴定，保存于-70℃含30%甘油肉汤中1.2PCR引物:由上海塞百盛生物工程公司合成(表1)。1.3常用试剂：基因组提取试剂、PCR试剂、DNAmarker等均为大连TaKaRa公司产品。1.4PCR扩增:用基因组提取试剂盒提取基因组模版，分别用sea、seb、sec、sed和see五对引物扩增各自目的基因，反应体系为：50μl总体积，10×PCR缓冲液(含Mg2+2.5mmol/L)5μl，引物各40pmol，dNTP各10umol，Taq酶2.5单位，模板2μl。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃表1本研究所用引物TABLE1Primersinthestudy引物名称序列产物长度(bp)参照GenBank号seasebsecsedseesense:5′-TGGTGCTTATTATGGTTATC-3′antisense:5′-TCTTGCTTGAAGATCCAACT-3′sense:5′-AAGGACACTAAGTTAGGGAA-3′antisense:5′-ATCATGTCATACCAAAAGCT-3′sense:5′-CTCAAGAACTAGACATAAAAGCTAGG-3′antisense:5′-TCAAAATCGGATTAACATTATCC-3′sense:5′-ATAGTAGTTTACCTGGGTCG-3′antisense:5′-AGTGTTCTTGATTAGCGTTT-3′sense:5′-CTTGGTTCAAAAGATGCTAC-3′antisense:5′-AAATCATAACTTACCGTGGA-3′217443271429383DQ641659AY852244AM778682.1M94872.1M21319.12结果表2.110株金黄色葡萄球菌中不同肠毒素基因检测结果分布TABLE2Resultdistributionofvariousenterotoxingenesin110staphylococcusaureusisolates肠毒素基因检出数量检出率%seasebsecsedsee总计416460303.6027.3表3.不同来源金黄色葡萄球菌株肠毒素基因检出率TABLE3Detectionrateofenterotoxingenesinstaphylococcusaureusisolatesfromdifferentsources来源肠毒素基因检出数量检出百分数%食物中毒14株食品监测样品96株总计110株141630100%16.7%27.33讨论在110株菌株中，肠毒素基因检测阳性30株，比率为27.3%，所有阳性菌株均只检出一种肠毒素基因，包括sea型4株（3.6%）、seb型16株（14.5%）、sec型4株（3.6%）和sed型6株（5.4%）四种类型，无明显优势类型，检出率低于有关文献报道[8]，原因有待探讨。30株含肠毒素基因菌株，14株来自两起食物中毒，均为seb型肠毒素基因（图1），食物中毒来源菌株肠毒素检出率为100%，和临床表现高度一致，提示肠毒素基因携带情况是引起食物中毒的重要因素，因此检测肠毒素基因可以用于评价致病风险。来源于食品监测样本的96株菌株检出16株肠毒素阳性，检出率为16.7%，显示在环境分离株肠毒素检出率明显低于中毒株（p<0.01）。不同肠毒素对人体的致病性存在差异，同时不同肠毒素还具有独特的生物学活性，如sea为超抗原，seb具有丝裂原活性等。研究食源性金黄色葡萄球菌分离株中肠毒素分布情况，对于评估金黄色葡萄球菌的致病性和疾病预后有重要意义。M：DNAmarker;1-2：肠毒素seb基因阳性(443bp)图1金黄色葡萄球菌部分肠毒素基因PCR扩增结果FIG1PCRfragmentsofenterotoxingenesamplifiedfromstaphylococcusaureus参考文献[1]BergdollMS.Staphylococcusaureus.In:DoyleMP,editor.Foodbornebacterialpathogens.NewYork,N.Y:MarcelDekker;1989.pp.463–523.[2]Dinges,M.M.,P.M.Orwin,andP.M.Schlievert.2000.ExotoxinsofStaphylococcusaureus.Clin.Microbiol.Rev.13:16-34.[3]McCormick,J.K.,J.M.Yarwood,andP.M.Schlievert.2001.Toxicshocksyndromeandbacterialsuperantigens:anupdate.Annu.Rev.Microbiol.55:77-104.[4]Bergdoll,M.S.,Robbins,R.N.,1973.Characterizationoftypesstaphylococcalenterotoxins.J.MilkFoodTechnol.36,610-612.[5]SH,TremaineMT,BeteleyMJ,etal.IdentificationandcharacterizationofStaphylococcalenterotoxintypeGandIfromStaphylococcusaureus[J],InfectImmun,InfectImmun.1998July;66(7):3337–3348.[6]BetleyMJ,BorstDW,RegassaLB.Staphylococcalenterotoxins,toxicshocksyndrometoxinandstreptococcalpyrogenicexotoxins:acomparativestudyoftheirmolecularbiology.ChemImmunol.1992;55:1–35.[7]McLauchlin,J.,G.L.Narayanan,V.Mi