新型冠状病毒基因溯源技术规范

DB36/XXXXX—XXXX新型冠状病毒基因溯源技术规范范围本文件规定了新型冠状病毒基因溯源样本的采集、运输与保存、全基因组测序、序列生成与比对和结果解读与反馈。本文件适用于卫生系统承担新型冠状病毒测序样本采集、运输、保存以及基因测序工作的实验室。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。(注：此章节需要列出正文部分引用的文件)GB19489实验室生物安全通用要求HJ91.1污水监测技术规范WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS/T640临床微生物学检验样本的采集和转运WS/T776农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范WS/T697新冠肺炎疫情期间特定人群个人防护指南《新型冠状病毒实验室生物安全指南》国家卫生健康委(国卫办科教函〔2020〕70号)《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》原卫生部(第45号令)《新型冠状病毒肺炎防控方案》《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发〔2010〕194号)《江西省病原微生物实验室生物安全管理办法》(赣卫科教发〔2018〕3号)《转发国家卫生健康委办公厅关于做好新型冠状病毒实验室检测生物样本管理工作的通知》（赣卫科教函〔2020〕1号）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。新型冠状病毒SARS-CoV-2Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2引起新型冠状病毒肺炎的病原体,为冠状病毒属的一个种。注:国际病毒分类委员会2020年2月11日将新型冠状病毒命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”。全基因组测序Wholegenomesequencing对生物样本整个基因组序列进行测定，获得完整的基因组信息。基因溯源样本采集基因溯源样本选取原则病例数较多时，应结合流行病学信息和病例传播链关系，优先选择以下样本开展测序：每起聚集性疫情的首代病例；感染来源不明的病例；早期感染者、与早期感染者有流行病学关朕的关键病例；有境外人员、中高风险地区人员、入境物品或冷链食品等接触史的病例；早期感染者接触的冷链食品、非冷链境外快递物流物品及其运输工具，以及关联的输入病例呼吸道、排泄物、污水等可能为疫情源头的病毒核酸阳性样本。应选择核酸检测结果Ct值小于32的样本进行测序（关键样本除外）。样本类型病例必须采集急性期呼吸道样本（包括上呼吸道样本或下呼吸道样本），重症病例优先采集下呼吸道样本，根据临床需要可留取大便样本。溯源过程的物品和环境需采集表面拭子样本，还可采集环境污水样本。采集方法人源样本：按照最新版《新型冠状病毒肺炎防控方案》的相关要求进行人员样本采集。食品及其包装表面拭子样本：按照WS/T776的相关要求进行食品及其包装表面拭子样本采集。物体表面拭子样本：按照WS/T776的第6项样本采集的相关要求进行物体表面拭子样本采集。污水样本：污水采样应符合HJ91.1的规定，按照WS/T776的第6项样本采集的相关要求进行污水样本采集。采集要求早期感染者、特殊职业、感染来源不明等关键病例可采集2份鼻咽拭子放置在1个釆样管内，以提高病毒载量用于病毒基因组测序。对早期感染者及其密切接触者排查发现的可疑物品、可疑场所在消毒前进行采样。采用非灭活型病毒采样管进行采样，确保采样管包装完好，在保质期内使用。溯源过程的物品和环境采样可釆取以下“两阶段、全覆盖、混釆”的原则：①第一阶段釆样：经流行病学调查针对病毒溯源初步指向的某物品或冷链食品进行采样时，应对该物品或冷链食品及同批次所有物品或冷链食品采取大范围涂抹方式进行全覆盖采样或高密度抽检。②第二阶段釆样：在第一阶段采样基础上，如果检出阳性样本，应以进行病毒全基因组测序和病毒分离培养为目标。样本运输与保存运输要求样本按WS/T640、《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》相关要求进行转运，由专人、专车4小时内送达实验室。样本转运箱封闭前，须使用75%酒精或0.2%含氯消毒剂消毒容器表面。样本保存用于病原检测的标本应当尽快进行检测，24小时内检测的标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件,则于-20℃冰箱暂存)。根据《转发国家卫生健康委办公厅关于做好新型冠状病毒实验室检测生物样本管理工作的通知》（赣卫科教函〔2020〕1号）相应要求所有新型冠状病毒实验室检测生物样本送至江西省疾病预防控制中心保存。全基因组测序实验室生物安全及个人防护应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠方法灭活前进行核酸提取及临床样本灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采用生物安全三级实验室（BSL-3)的个人防护；感染性材料或活病毒在采用可靠方法灭活后进行的核酸检测操作应在BSL-2进行。实验室应符合GB19489、WS233、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》、《江西省病原微生物实验室生物安全管理办法》的相关要求；个人防护则符合WS/T697的相关要求。设备核酸提取仪、PCR扩增仪、核酸定量仪、高通量测序仪。试剂核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、新冠病毒多重反应的PCR扩增试剂盒、DNA纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒。耗材微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、8联管磁力架、1.5mLEP管、0.2mL8联管、96孔PCR板。核酸提取根据核酸提取试剂盒说明书在核酸提取仪上提取核酸。cDNA合成以提取的核酸为模板,采用第一链cDNA合成试剂盒，根据试剂盒说明书在PCR扩增仪上制备第一链cDNA。多重PCR扩增采用新冠病毒多重PCR扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置多重PCR扩增引物和扩增体系，对cDNA进行多重PCR扩增。PCR产物的纯化用DNA纯化磁珠法对扩增产物进行纯化,以TEbuffer或无核酸酶水对纯化产物进行洗脱。纯化产物的定量及DNA文库制备使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行双链DNA定量，根据所使用的建库试剂盒说明书进行文库制备。上机测序根据高通量测序试剂盒和高通量测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。序列生成对下机数据进行质控、拼接a）去除测序数据中的PCR引物序列(按照最大引物长度30bp进行Trim)、adapter和低质量的Reads。b)对下机数据进行QC分析，判断测序质量是否达到要求。以SARS-CoV-2参考基因组(GeneBank序列获得号：NC_045512)为模板进行序列mapping拼接,mapping之后对测序覆盖度和测序深度进行分析，最终生成一致性(consensus)序列，即为待溯源样本的全基因组序列。软件分析使用商品化新冠分析软件，按照软件说明书操作。结果解读与反馈a）将待溯源样本的全基因组序列同SARS-CoV-2参考基因组(GeneBank序列获得号：NC_045512)进行比对，分析出突变位点。b）利用Pangolin分析工具对序列进行分析，获得该序列属于的变异株以及进化分支。c）将待溯源样本的全基因组序列同本地数据库中的本地病例及输入病例的全基因组序列数据库进行比对，分析是否可能为本地传播。d）将待溯源样本的全基因组序列同全国其他地区的序列数据库进行比对分析，分析是否可能为外省输入。e）根据序列分析结果，结合流行病学证据，对该待溯源样本进行综合分析判断，分析引起疫情的病毒来源，得出溯源结论。参 考 文 献中华人民共和国传染病防治法中华人民共和国生物安全法新型冠状病毒实验室生物安全指南新型冠状病毒肺炎防控方案（第九版）医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册江西省疾控机构新型冠状病毒核酸检测工作手册新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南WorldHealthOrganization(2020)Surfacesamplingofcoronavirusdisease(COVID-19):apractical“howto”protocolforhealthcareandpublichealthprofessionals,18February20