微生物技术-课件

食源性致病微生物是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类微生物（古菌、细菌、真菌、病毒等）。近年来，全球食品安全事件频频发生，如美国的“李斯特氏杆菌事件”、日本的“大肠杆菌0l57流行事件”等，对人类健康带来很大危害，引起各国政府的全力关注。传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)无法对难培养或不可培养的致病微生物进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测、预防作用。因此，发展新的快速检测与鉴定食源性致病微生物的方法是及时有效地控制和预防致病微生物传播的前提。

I.国内外食源性致病微生物检测新技术研究与应用进展1ppt课件食源性致病微生物是指以食物为载体，导1国内外食源性致病微生物检测新技术

免疫学检测技术聚合酶链反应(PCR)等技术生物芯片技术代谢学技术其它技术2ppt课件国内外食源性致病微生物检测新技术免疫学检测技术2ppt课件2精品资料精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”微生物技术--ppt课件4一免疫学检测技术

免疫荧光技术免疫磁性分离技术免疫胶体金技术酶联免疫吸附检测(ELISA)酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)

免疫学检测技术将抗原-抗体反应的特异性与标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)的相结合，是一种可以定位、定性和定量的综合技术，具高专一性和高敏感度。5ppt课件一免疫学检测技术

免疫荧光技术免疫学检测技术将抗原51.免疫荧光技术原理与特点：免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。此技术的主要特点有特异性强、敏感性高、速度快。应用：此技术可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E·ColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌等进行快速检测。王军等建立了养殖大黄鱼病原溶藻弧菌的荧光抗体免疫快速检测技术。6ppt课件1.免疫荧光技术原理与特点：免疫荧光技术就是将不影响抗原抗62.免疫磁性分离技术原理与特点：免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性的结合，载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病菌不断得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养过程，可特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。应用：Skjerve等报道了采用免疫磁性分离技术，从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离沙门氏菌，其检测灵敏度为100CFU／g。在英国，此法主要应用于牛奶中大肠杆菌O157：H7的监测和食品中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌)等的检测。在实际应用中，还可以与直接镜检技术、阳抗技术、酶联免疫试验、PCR等技术相结合应用。此外，以免疫磁性分离技术为基础的免疫胶体金技术已成功应用于Ol群霍乱弧菌的检测。

7ppt课件2.免疫磁性分离技术原理与特点：免疫磁性分离技术是将特异性73.免疫胶体金技术

原理与特点：免疫胶体金技术起源于1971年Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门菌。其基本原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。其特点是单份测定、简单快速、特异敏感，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。8ppt课件3.免疫胶体金技术原理与特点：免疫胶体金技术起源于19784.酶联免疫吸附检测(ELISA)原理：1971年Engvall建立了ELISA方法，它以酶或者辅酶作为标记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，并且利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体，使其固相化，在其中进行免疫反应和酶促反应。根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。特点：由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。ELISA具有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、检测速度快、样品处理量大、以及费用低等优点，弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。9ppt课件4.酶联免疫吸附检测(ELISA)原理：1971年Engva9应用：ELISA技术自二十世纪70年代出现开始，在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，单克隆抗体技术的应用，使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高，并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、适用范围宽、携带方便、且易商品化、操作简便和经济实惠，它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术，常以试剂盒的形式出现。10ppt课件应用：ELISA技术自二十世纪70年代出现开始，在临床和生物10完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：(1)包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)；(2)酶标记的抗原或抗体；(3)酶的底物：(4)阴性和阳性对照品(定性测定)，参考标准品和控制血清(定量测定)；(5)结合物及标本的稀释液；(6)洗涤液；(7)酶反应终止液。结合物为酶标记的抗体(或抗原)，是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)。国产ELISA试剂一般都用HRP制各结合物。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。11ppt课件完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：(1)包被抗原或抗体的11

近年来，该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用，如微生物污染、天然毒性物、人兽共患疾病病原体检测等方面的检测分析。微生物污染：KryinskiandHeimsch等(1977)首次将ELISA用于食品沙门氏菌(Salmonellaspp．)的检测，并在应用中不断得以发展。目前有许多种方法，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多，检测结果准确可靠。例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU／g，仅需22h，比常规方法缩短了3～4d，与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌检测系统，实现了整个过程的自动化，全程耗时仅为45min。毒素检测：真菌毒素(mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物，其中的十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世，至今，几乎所有重要真菌毒素(如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA检测方法均已建立。12ppt课件近年来，该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推12

人兽共患疾病病原体检测：海绵状病毒(BSE)是牛的一种致死性神经系统疾病，它与人群发生变异型克雅氏病(VCJD)有关。对于该病病原，普遍认为是由一种蛋白质性的感染颗粒也称朊蛋白，是一种病理性细胞朊蛋白(PrPSc)，由正常的细胞朊蛋白(PrPc)转变而来。蛋白酶核心位点的抗体应用于检测正常及BSE动物脑组织PrPc的含量，对于天然组织，两组差异很小，但经加热及异硫氰酸胍处理后，ELISA可将牛脑匀浆物中BSE特异性的PrPSc与PrPc区分开来，无明显临床症状的BSE感染动物可被检出，经对朊蛋白Western印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的灵敏度、特异性及可靠性进行分析，证明该方法是有效的。此外，在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已形成试剂盒生产能力。13ppt课件人兽共患疾病病原体检测：海绵状病毒(BSE)是13ELISA技术的发展趋势高度免疫原性的重组抗原：通过基因工程技术可以快速、批量地生产出具有高度免疫原性的重组抗原，用来替代某些无法从天然材料中分离的抗原物质，进一步地扩大了ELISA检测分析范围。重组抗原在纯度上要高于通过裂解病原体所提取的抗原。用于检测的重组抗原有可能最终达到以下两个标准：(1)包括所有能引起机体强免疫应答的病原体抗原决定簇：(2)不含或尽可能少含非特异性抗原或共同抗原。多项标志物快速测定：利用酶联免疫技术同时对待检样本中的多项标志物进行快速测定。这对于某些常需同时测定的标志物来说，可节省测定时间。可以通过以下两种方法来达到这一目标：(1)通过基因工程技术表达特定的融合蛋白质将多种不同蛋白质的功能构建在一起，可以快速方便地同时检测多项标志物；(2)采用几种能够催化各自底物产生不同颜色反应的酶，分别标记具有不同特异性的抗体或抗原，反应后用其各自的酶底物显色，从而达到了同时检测多项标志物的目的。14ppt课件ELISA技术的发展趋势高度免疫原性的重组抗原：通过基因工14天然酶定向改造和体外分子进化：运用天然酶定向改造和体外分子进化手段，研究开发的免疫测定标记用酶融合蛋白(一种同时具有催化底物显色反应酶活性和特异性抗体或抗原性质的融合蛋白)可以作为结合物(酶标记的抗原或抗体)直接用于ELIAS试剂盒。这使得ELIAS试剂盒在其生产过程中不但避免了繁琐且低效率的酶与特异性抗体或抗原的化学交联过程，而且无需得到纯化的酶和抗体或抗原，从而大大地提高了ELIAS试剂盒产品的稳定性，使其结果具有更好重复性。自动化的酶联免疫测定技术.近年来所出现的全自动酶标测定分析仪，不但减轻了实验室人员的劳动强度，而且大大提高了测定的准确性和重复性。这样有利于ELISA技术在检测分析中的进一步商品化推广。15ppt课件天然酶定向改造和体外分子进化：运用天然酶定向改造和体外分子进155．酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)原理与特点：酶联荧光免疫分析技术将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物，就可提高分析的灵敏度和增宽测量范围，减少试剂的用量。酶放大技术、固相分离及荧光检测三者的联合将成为荧光免疫分析中最灵敏的方法。应用：陈思强等采用自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中沙门氏菌。16ppt课件5．酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)原理与特点：酶联荧光免16二聚合酶链反应(PCR)技术rRNA序列分析法依赖PCR的DNA指纹图谱技术多重PCR检测技术(m-PCR)实时荧光定量PCR检测技术

聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法，在食源性致病微生物的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。

17ppt课件二聚合酶链反应(PCR)技术rRNA序列分析法17PCR原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

18ppt课件PCR原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依182．依赖PCR的DNA指纹图谱技术1)随机引物扩增DNA多态性(RAPD)。随机引物扩增DNA多态性主要用于不考虑微生物核酸精确序列的情况下，比较微生物间的DNA指纹图谱差异，用于细菌种问的鉴定，Black等将毛细管热循环仪及RAPD技术用于李斯特氏菌(ListeriaPirie)的鉴定，3h即可出结果。依赖PCR的DNA指纹图谱技术是通过各种改进的PCR技术，使目标微生物的核酸经扩增后，产生多条DNA扩增片段(特异性和非特异性的)，通过统计分析，找出某种微生物的特有条带，进行区别鉴定。19ppt课件2．依赖PCR的DNA指纹图谱技术依赖PCR的192)基因内重复性一致序列(ERIC)的扩增.ERIC片段是存在于肠道细菌核酸中的重复DNA序列，含有一段高度保守的中心反转重复序列，分布在细菌染色体的不同位点上且以不同的距离分隔，因此，以这些重复的DNA片段作为PCR扩增时引物的结合位点，使其被分隔的片段大量扩增，在凝胶电泳上形成一系列的条带，从而区分不同的肠道细菌。Versalovio等曾用与ERIC重复序列互补的寡核苷酸片段作为引物及斑点杂交DNA探针来检测包括大肠杆菌(E．coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)等不同菌种间存在的特异DNA指纹图谱。与RAPD相比，此法引用的引物序列固定，结果的重复性更好。20ppt课件2)基因内重复性一致序列(ERIC)的扩增.20ppt课件203）食品中致病菌靶基因的PCR检测21ppt课件3）食品中致病菌靶基因的PCR检测21ppt课件21沙门菌可致多种感染．轻者为自愈性胃肠炎，重可引起致死性伤寒。沙门菌主要含有3种抗原结构，即菌体(0)抗原，鞭毛(H)抗原及表面抗原(Vi抗原等)。沙门菌有较强的内毒素，引起发热，白细胞改变，中毒性休克，并能激活补体系统．某些沙门菌能产生类似大肠埃希菌的肠毒素，有Vi抗原的沙门菌具有侵袭力，而且被细胞吞噬后，不被破坏。3．1invAgene是编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因，是一段只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列[】]。它是毒力岛SP11基因之一。3．2伤寒沙门茵鞭毛抗原基因虽然鞭毛抗原Hd也存在于其他沙门菌中，但其高变区1072—1089区域为伤寒沙门菌所独有[】，还可以用sefA基因(编码鞭毛的抗原)设计引物用PCR方法检出沙门菌。3．3ViaBgene致病的伤寒沙门菌都具有Vi抗原，vi多糖抗原为N一乙酰半乳糖胺糖醛酸多聚物，Vi抗原产物由染色体中ViaA和ViaB两组基因所控制，其中ViaB基因被认为是Vi抗原表达的特异结构基因[]。3．4hjlAgene编码沙门菌侵袭基因正调节蛋白，与沙门菌对肠道上皮细胞侵袭力有关。3．5rfbgene革兰阴性菌外膜主要成分为脂多糖(Lipopo—lysaccharide，LPS)，其多糖部分(含0一特异性多糖和核心多糖)参与了细菌对宿主细胞的黏附，侵袭和在细胞间扩散的过程，是细菌的致病因子之一，而LPS的0抗原部分由rfb基因编码。3．6ompCgene编码沙门菌外膜蛋白基因。22ppt课件沙门菌可致多种感染．轻者为自愈性胃肠炎，重可引起致死性伤寒。223．多重PCR检测技术(m-PCR)原理与特点：PCR技术已经运用于食品中单一致病菌的检测，并得到一定程度的推广，但食品中往往含有多种致病菌。多重PCR的建立，实现了多种食源性致病菌的同时检测。m-PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种致病菌的目的。M-PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂。但也存在较明显的不足：扩增效率不高、敏感性偏低；扩增条件需摸索与协调；可能出现引物间干扰等。应用：1999年，R．Y．C．Kong等运用m-PCR技术，用六对引物分别对产毒素性大肠杆菌(ETEC)的不耐热肠毒素LT1、LT2和ST1基因、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)的VT1、VT2基因及肠道致病性大肠杆菌(EPEC)的EAE毒素基因同时进行扩增，对88株从水环境中分离的菌株进行筛查，监测了水样受粪便污染的程度，检测灵敏度达到100CFU，100u1。2002年又通过多重PCR实现了海水中气单胞菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌六种病原细菌的同时快速检测。我国学者严笠等应用m-PCR，在同一扩增体系中同时扩增了大肠埃希氏菌O157：、沙门氏菌和志贺氏菌特征性基因，最后通过凝胶电泳实现了这三种致病菌的同时快速检测，取得理想结果。23ppt课件3．多重PCR检测技术(m-PCR)原理与特点：PCR技术已234．实时荧光定量PCR检测技术

原理与特点：实时荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，有效地解决了内标定量PCR只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值(每个反应内的荧光信号到达设定的域值所经历的循环数，Cyclethreshold)计算，根据标准曲线得定量结果，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。24ppt课件4．实时荧光定量PCR检测技术原理与特点：实时荧光定24Ct值是如何得到的？在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。25ppt课件Ct值是如何得到的？25ppt课件25Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。提高了检测的灵敏度和特异性。26ppt课件Ct值的定义26ppt课件26荧光定量PCR的2类方法

1.染料法（SYBRGreen法）染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结合并在497nm激发下。染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。染料法的缺点：1，由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBRGreen的上述特点，该方法不能应用于MultiplexQPCR技术。（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）27ppt课件荧光定量PCR的2类方法1.染料法（SYBRGree272.探针法（以TaqMan探针为例）

探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。目前市场上的探针主要种类有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。

TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2，对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行MultiplexQPCR。与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。28ppt课件2.探针法（以TaqMan探针为例）28ppt课件28TaqMan探针法工作原理：1、变性（95°C）：模板dsDNA充分解链；2、复性、延伸、酶切降解（60°C）：1）探针与靶序列结合；2）上、下游引物与靶序列结合；3）上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5’→3’聚合功能）；4）当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；3、荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。29ppt课件TaqMan探针法工作原理：1、变性（95°C）：模板dsD29三、生物芯片技术近几年来，人们普遍较为关注“生物芯片”和“微芯片”在食源性致病菌等微生物的检测。在设计生物芯片时，可以在芯片上加上不同种类的抗体或者DNA分子，以便在同一个片上同时完成对沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、葡萄球菌等的检测。据Heron报道，生物芯片在本世纪会有举足轻重的作用，其市场价值可达50亿美元之高。1.基因芯片(genechip)技术2.免疫芯片技术30ppt课件三、生物芯片技术近几年来，人们普遍较为关注“生物芯片”和“301.基因芯片(genechip)技术原理：基因芯片是二十世纪90年代中期诞生的一项新型生物技术。将各种基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC等)寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。该技术可检测各种环境或媒介中的微生物，研究复杂微生物群体的基因表达。特点:与传统方法相比，基因芯片技术先进性主要体现在：(a)基因芯片可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；(b)操作简便快速，整个检测4h基本可以出结果，而传统方法一般需4～7d时间；(C)特异性强，敏感性高。31ppt课件1.基因芯片(genechip)技术原理：基因芯片是二十世31具体方法PCR扩增引物、芯片探针的设计与合成。基因芯片的制备。样品的采集制备和DNA分离纯化。杂交检测和结果分析。32ppt课件具体方法PCR扩增引物、芯片探针的设计与合成。32ppt课件32应用：基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。近年来许多研究者对基因芯片分析检测食品中常见致病菌进行了一系列探讨。勒连群等采用合成后点样的方法，把自行合成的一系列寡核苷酸探针固定在经过醛基化修饰的显微镜载玻片上，制成用于致病菌检测的基因芯片。在相同的条件下，扩增了涉及12个菌属的151株细菌的16SrDNA基因片段并与基因芯片杂交，经ScanArray3000芯片阅读仪扫描得到特异性的杂交图，得到一套属(种)特异的典型杂交图谱，然后将待检的样品菌与基因芯片进行杂交，得到的杂交结果与典型图谱比对即可判断出样品的种类，准确率达到96．2％。唐晓敏等利用此技术检测水中常见致病菌，与传统方法鉴定结果一致性为95％，并且对于一个未知菌落，可以在4h之内完成菌种判断，为快速检测与鉴定常见致病菌提供了有效的手段。33ppt课件应用：基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原33FunctionalGeneArrays(FGA)forMicrobialCyclingofC,S,N,andPCalvincycle:500rTCAcycleAcetyl-CoA3-HPProbesavailablefortargetingCO2fixationgenes:Nitrogencycling:5089Sulfurcycling:1006Phosphorusutilization:438Carbondegradation:>1000Probesavailablefortargetingotherfunctionalgenes:}300ABCD34ppt课件FunctionalGeneArrays(FGA)f34Fig.7HierarchicalclusteranalysisofmcrAgenerelationshipsbasedonhybridizationsignalintensity.RepresentativegenesversusdepthwatersamplescollectedfromMC118andGC234ofGOM.ThetreewasgeneratedusingCLUSTERandwasvisualizedwithTREEVIEW.Blackindicatesnodetectablehybridizationabovethebackgroundlevels,whileredindicatespositivehybridizationsignals.Thecolorintensitiesindicatedifferencesinhybridizationsignalintensity.35ppt课件Fig.7Hierarchicalclusteran352.免疫芯片技术免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗体微点阵，是在载体上已设计好的微阵列方式同定多种抗体或抗原，用标记物标记抗体或抗原，利用配体间特异的相互作用方式进行反应、结合，然后通过特定的扫描装置进行检测，结果由计算机分析处理。高志贤等已将该技术用于检测葡萄球菌肠毒素。36ppt课件2.免疫芯片技术免疫芯片是指包被在固相载体上的高密度抗原或抗36四.代谢学技术电阻抗技术微热量计技术放射测量技术接触酶测定技术37ppt课件四.代谢学技术电阻抗技术37ppt课件371.电阻抗技术电阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中，会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，即可判定细菌在培养基中的生长繁殖特性。该法已用于食品中细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、霉菌和支原体的检测，具有高敏感性、特异性、反应快和高度重复性等优点。李小燕应用此法来快速检测鲜奶中大肠菌群。38ppt课件1.电阻抗技术电阻抗技术是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中，382.微热量计技术微热量计技术(Microcalorimetry)是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量，用微量热计测量产热量等数据，均存储于计算机中，经过适当信号上的数字模拟界面，在记录器上绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图。根据这些实验所得的热曲线图，和已知细菌热曲线图直观比较，即对细菌进行鉴别。刘永军等采用该技术研究细菌的抑制作用。39ppt课件2.微热量计技术微热量计技术(Microcalorimetr393.放射测量技术

放射测量技术是根据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物的CO2的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测的。在细菌生长时，这些底物被利用并释放出含放射性的14CO2，然后通过自动化放射测定仪Bactec测量14CO2的含量，从而根据。14CO2含量的多少来判断细菌的数量。这一方法已用于测定食品中的细菌，具有快速、准确度高和自动化等优点。减改华等应用放射测量技术对大肠杆菌进行定量检测。40ppt课件3.放射测量技术放射测量技术是根据细菌404．接触酶测定技术接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶的纸盘，在盛有H2O2的试管中的漂浮时间来估计菌数。接触酶与H2O2之间产生生化反应，放出氧气，使纸盘由试管底部浮到表面。当样品中接触酶含量高时(表明接触酶阳性细菌含量高)，纸盘上浮的时间短(以秒计)。大多数腐败微生物是嗜冷性细菌。而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故可以用接触酶反应来估计食品中的嗜冷性菌群。41ppt课件4．接触酶测定技术接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶的纸41II.其它微生物研究技术1、rRNA序列分析法2.DNA碱基比例的测定（G+Cmol%）3.DNA-DNA分子杂交

4.全基因组测序5.蛋白质分析6.双向电泳（2-DE）技术7.质谱（MS）技术8.电镜观察42ppt课件II.其它微生物研究技术1、rRNA序列分析法42ppt课421、rRNA序列分析法

rRNA序列分析大大推动了微生物分类学的发展。微生物含有3个rRNA分子：23S、16S和5S，它们序列长度分别约为2900、1540、120bp。其中16SrRNA分子量适中，含有较大信息量，碱基顺序保守性强且稳定，是鉴别生物间进化关系的重要分子，也是研究生物系统进化过程中的分子钟，一般认为，16SrDNA序列同源性小于97%可以认为属于不同的种，同源性小于93-95%可以认为属于不同的属（崔宗均，2003；Dongetal，1997）。16SrRNA的序列分析表明它在种以上微生物相关性具有很高的分辨力，但在进化关系密切的微生物种内的分辨力还是有限的（Dongetal，1997；Mrabetetal，1992），因此16SrRNA对于划分种的界限没有确切的数值（Tamaoka，1994）。43ppt课件1、rRNA序列分析法rRNA序列分析大大推动了微生物43BL1菌株的鉴定。A：BL1基因组，B：16SrDNAPCR结果，C：重组质粒的酶切验证44ppt课件BL1菌株的鉴定。A：BL1基因组，B：16SrDNAP449株菌遗传进化树45ppt课件9株菌遗传进化树45ppt课件452.DNA碱基比例的测定（G+Cmol%）G+C含量是应用最普遍的分类指标之一，这个参数在种和属的描述中通常是必须的（Tamaoka，1994）。对其测定最常用的是热变性温度法（Tm法）、高效液相色谱法，其次是浮力密度法（SandmanandReeve，2000）。在微生物中G+C含量介于20-80%之间（Melchior，1982）。两种生物之间G+C含量的差异越大，它们的进化关系就越远，理论上说DNA分子之间G+C含量的差异超过20-30%时，它们的序列是完全不同的（王顺民，2004）。一般地，G+C含量相差在5%以上可以认为是两个不同的种，若相差超过10%则属于不同的属。46ppt课件2.DNA碱基比例的测定（G+Cmol%）G+C含量是463.DNA-DNA分子杂交

DNA-DNA分子杂交仍然是目前鉴定种属的标准方法（StackebrandtandGoebel，1994）。根据DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热使其变性，并在合适的条件下使互补的碱基重新配对，然后测定杂交的百分率。百分率越高，说明两者间碱基顺序的同源性越高，即其间的亲缘关系越近。从实验得知，各菌株DNA的同源性在70%以上的属于种的水平；在20%以上的，则可能属于属的水平（Sriprapundhetal，2000）。47ppt课件3.DNA-DNA分子杂交DNA-DNA分子杂交仍然是目474.全基因组测序基因是生物体遗传信息的关键载体，决定着生物体的遗传特征和主要个体差异。自摩尔根提出这一概念后，一直有所争论。但在1949年发现基因序列中单个碱基的突变即可导致地中海贫血病后，科学界的观点趋于一致。在20世纪下半叶，随着有关研究手段的改进，对人类基因及其与疾病的关系的研究成为生命科学中最重要的领域之一。1990年10月，国际人类基因组计划在美国启动，美、英、日、德、法、中国相继参加了这一宏伟计划。2001年6月26日完成人类基因组工作框架图（Venteretal，2001）。由于微生物具有结构简单，基因组小，多数为无性繁殖，可人工培养等特点，作为分子生物学及相关基础生物学研究的材料，是一种良好的模式生物。20世纪中，共有57名诺贝尔奖金获得者进行的研究与微生物相关。有关研究不仅开辟了对其致病机理研究、新型疫苗和药物研究的新领域，也将为微生物及其产物的利用开辟新天地，并将为揭示一系列诸如生命起源、生物发育和进化等生命活动的重大问题提供极大的帮助。全基因组测序通常采用霰弹法（Shot-gun）和逐步克隆(Clonebyclone)两种策略。全基因组霰弹法测序策略是直接将全部基因组DNA打成小片断进行随机测序，