【生物】微生物的基本培养技术课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第一章发酵工程1.2微生物的培养技术及应用固体培养基盛有液体培养基1.2微生物的培养技术及应用第二课时微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养0102微生物的数量测定03土壤中分解尿素的细菌的分离与计数04本节聚焦怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？测定微生物数量的常用方法有哪些？01选择培养基

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢?选择培养基01选择培养基1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。1.为什么水生栖热菌能更容易在热泉中找到并被筛选出来呢？这是因为水生栖热菌适应热泉的环境，能在70~80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。2.在自然界中，想进行微生物筛选的原则是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。实验室筛选微生物原理：人为提供_______________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_______________________根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH耐热微生物耐寒微生物石油分解菌01选择培养基选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。不加碳源的培养基分离出自养微生物不加氮源的培养基分离固氮微生物加青霉素的培养基分离真菌加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌

改变培养条件

添加某种化学物质

营养缺陷选择培养基类型01选择培养基耐高温微生物高温环境下培养厌氧型和兼性厌氧型微生物无氧环境下培养④特殊碳、氮源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?培养基中加氨苄青霉素具有氨苄青霉素抗性的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌培养基应有菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？

应设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）作为对照，若基础培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则说明该选择培养基具有选择性。（1）目的：分离酵母菌、霉菌等真菌，防止细菌生长

原理：青霉素能抑制细菌生长，对真菌无作用

配制：使用____________的培养基（2）目的：分离固氮菌

原理：固氮微生物能利用空气中的氮气

配制：使用_______________________的培养基（3）目的：分离自养型微生物

原理：自养型微生物能利用无机碳源

配制：使用___________________________的培养基（4）目的：分离耐酸菌

原理：耐酸菌能在pH为酸性的条件下生长

配制：使用_______________的培养基加入青霉素不加氮源（以N2为氮源）不加有机碳源（以CO2为碳源）将pH调至酸性01选择培养基应用允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基微生物碳源氮源能源蓝细菌CO2光能硝化细菌NH3NH3的氧化根瘤菌N2有机物大肠杆菌糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物自养微生物异养微生物CO2糖类等有机物下表是某微生物培养基的成分，请分析该培养基可用来培养哪种微生物？若除去①，此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？编号①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4g4.0g0.5g0.5g100mL此培养基可用来培养自养型微生物。

圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供有机碳源，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例图示加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落呈金属光泽的深紫色)选择培养基与鉴别培养基的比较鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。伊红和亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌课本P30刚果红培养基鉴别纤维素分解菌课本P20当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈思考·讨论选择培养基配方的设计

尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，尿素施入土壤中，需要土壤中的细菌将尿素分解成NH3，NH3再转化为NO3-、NH4+等被植物利用。而这些细菌之所以能分解尿素是因为它们能合成脲酶。脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3NO3-NH4+脲酶转化2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基相比较，共同点是都认有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。1：你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？

培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。1．下表是培养某种微生物的培养基配方，说法错误的是（

）组分含量KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4-7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mLA．该培养基从功能上分属于选择培养基B．使用稀释涂布平板法才能得到单菌落C．配制微生物培养基时，不一定含碳源D．在培养细菌时，需将培养基调至中性或弱碱性B2．某同学用下表所示的培养基培养纤维素分解菌。下列叙述正确的是（）（青霉素会抑制细菌生长）成分NaNO3K2HPO4KClMgSO4·7H2OFeSO4葡萄糖H2O青霉素含量3g1g0．5g0．5g0．01g30g1L0．1万单位A．根据物理性质，该培养基属于固体培养基B．该培养基可用来筛选抗青霉素的微生物C．该微生物的培养基适合新冠病毒的培养D．该培养基用于培养纤维素分解菌，应除去葡萄糖，添加纤维素B02微生物的选择培养1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？

不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。

分离方法：稀释涂布平板法02微生物的选择培养稀释涂布平板法两个基本操作：梯度稀释和涂布平板1、内容是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。（2）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。①取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌（1）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基2、实验步骤1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水10g02微生物的选择培养稀释涂布平板法（3）样品的稀释②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。沥干移液枪02微生物的选择培养稀释涂布平板法02微生物的选择培养稀释涂布平板法（4）培养与观察：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。稀释涂布平板操作后分离得到单菌落02微生物的选择培养稀释涂布平板法（5）注意事项：1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，再计算时，不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰附近进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。1.图甲所示是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙所示是平板划线法的操作结果。下列相关叙述错误的是A.图甲中涂布前要将涂布器

灼烧，冷却后才能涂布菌液B.对于浓度较高的菌液，若

图甲中的最高稀释倍数仅

为102，则所得到的菌落

不一定是由单一的细胞繁殖而成的C.图乙所示培养皿中每个划线区域都可得到符合要求的菌落D.图乙中连续划线的起点是上一次划线的末端(除第一次划线外)√02微生物的选择培养3、常用微生物分离方法比较主要方法稀释涂布平板法平板划线法主要步骤接种工具菌体获取能否用于计数共同点系列梯度稀释操作和涂布平板操作接种环在固体培养基表面连续划线涂布器接种环从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板不能计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。03微生物的数量测定计数：测定分解尿素的细菌的数量稀释涂布平板法显微镜直接计数法——间接计数法——直接计数法1.间接计数法——稀释涂布平板法当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目稀释104倍稀释105倍稀释106倍稀释107倍保证合理稀释度（1）原理

在不同稀释度的菌液接种后，只有在一定的稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞，从而能够在培养基表面形成单个菌落；如果稀释度过低，将不会形成单个菌落；如果稀释度过高，可能没有菌落生成。03微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法注意事项03微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（2）计数原则2.同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，求平均值（要分析3个重复值得差值大小）1.选择30-300个菌落的平板进行计数。3.涂布要均匀4.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。5.统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照尽量减少误差恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是()A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233D03微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（3）计数公式每克样品中的活菌数≈(C÷V)×MC：平板上平均菌落数；V：涂布所用体积(mL)；M：稀释倍数。实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个

某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学____________________________________；原因是______________________________________。2.乙同学____________________________________；原因是______________________________________。实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太大，应舍去03微生物的数量测定应用03微生物的数量测定2.直接计数法——显微镜直接计数法快速、直观两者计数原理相同，血细胞计数板比细菌计数板厚原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。优点：缺点：

不能区分死菌与活菌→统计值偏大不适于对运动细菌的计数对细菌等较小的细胞进行观察和计数常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数思考:为了避免上述缺点，我们该如何做？可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据菌株本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×M

C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌操作复杂，有一定误差，比如当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小归纳总结04探究•实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？提出问题作出假设实施实验设计实验分析结果利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。1.土壤取样2.制备培养基（尿素为自变量）3.样品稀释与取样涂布4.微生物的培养与观察

细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。1.土壤取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意04探究•实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实施实验2.制备培养基04探究•实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实施实验①实验组：以尿素为唯一氮源的选择培养基②对照组：目的：作为对照组用以判断选择培养基是否具有选择作用牛肉膏蛋白胨培养基(普通培养基）选择培养基配方：在该培养基上的菌落一定是能分解尿素的细菌吗？不一定，比如固氮菌；还有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖。因此还需要进一步的鉴别。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红①提供无机盐；②调节pH3.样品的稀释04探究•实践①稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数②稀释标准：测定土壤中的细菌的数量，一般选用_______________________倍稀释液进行平板培养1×104、1×105和1×106③初次实验，可以将稀释的范围放宽一点，例如可以将_________________倍稀释液分别涂布培养，以保证___________________________________________。1×103~1×107能从中选择出菌落数为30~300的平板进行计数测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液4.涂布平板04探究•实践选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)04探究•实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数5.培养与观察将平板____于______℃的恒温培养箱中培养1~2天。每隔24小时统计一次菌落数目,选取________________时的记录做结果。倒置30~37菌落数目稳定

一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（鉴别指示剂）04探究•实践结果分析与评价内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长实验组培养基中菌落数偏高选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目未被杂菌污染被杂菌污染选择培养基具有筛选作用1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。①判断培养基是否有杂菌污染：②判断选择培养基是否有筛选作用：放入未接种的培养基；

放入接种后的完全培养基。该组平板上如果没有菌落生长，可以说明培养基在使用前未被杂菌污染;04探究•实践结果分析与评价本实验中有两组对照：

一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板

牛肉膏蛋白胨培养基适合几乎所有土壤微生物的生长和繁殖，如果该组平板上的菌落数显著多于同一稀释度的菌液涂布的选择培养基平板上的，可以说明选择培养基具有选择作用。04探究•实践结果分析与评价2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。

从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，正确的是（

）A．土壤取样→梯度稀释→平板划线操作→挑选菌落B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落微生物的数量测定选择培养基的作用微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法微生物的选择培养和计数选择培养基微生物的选择培养科学实例筛选原则选择培养基的概念及举例稀释涂布平板法的操作过程间接计数法—稀释涂布平板法直接计数—计数板计数法土壤中分解尿素的细菌的分离与计数培养基的制备实验设计（1）土壤取样（2）样品的稀释（3）稀释涂布平板法接种（4）微生物的培养与观察结果分析小结1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。(1)这种培养基是一种选择培养基。（

）(2)用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（

）(3)相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。(

）√√√2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（

）A.菌落中的细菌数目是固定的B.平板上的一个菌落就是一个细菌C.通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D.平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D课后练习与应用1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。

反刍动物的瘤胃高度缺氧，有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备以尿素为唯一氮源的选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。课后练习与应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。课后练习与应用(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？

纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。如图是从土壤中分离能降解纤维素的微生物实验过程流程图。下列有关叙述正确的是()A.该实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基中一定要添加适量的纤维素B.过程①不能提高所选微生物在培养物中的比例C.过程②纯化经过③培养后获得的单细胞菌落属于种群层次D.④的操作是挑取单菌落进行菌种鉴定并在皿盖及时做上标记C核心归纳项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例图示加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化