碱性磷酸酶值测定

关于碱性磷酸酶值测定实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理

E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等第2页,共18页，2024年2月25日，星期天（一）米－曼氏方程式中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P相关E学原理第3页,共18页，2024年2月25日，星期天※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]

＝──第4页,共18页，2024年2月25日，星期天当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第5页,共18页，2024年2月25日，星期天（二）Km与Vmax的意义

Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)

Km是酶的特征性常数之一；b)

Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)

同一酶对于不同底物有不同的Km值。

第6页,共18页，2024年2月25日，星期天

Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。第7页,共18页，2024年2月25日，星期天（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法-1/Km1/Vmax1/[S]1/VVmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数第8页,共18页，2024年2月25日，星期天2.Hanes作图法[S][S]/V-KmKm/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax第9页,共18页，2024年2月25日，星期天酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0V

[E]

当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]

酶浓度对反应速度的影响

第10页,共18页，2024年2月25日，星期天双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060

温度ºC

温度对淀粉酶活性的影响

第11页,共18页，2024年2月25日，星期天pH对反应速度的影响最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pH

pH对某些酶活性的影响

胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810第12页,共18页，2024年2月25日，星期天碱性磷酸酶km值的测定第13页,共18页，2024年2月25日，星期天操作试剂（ml）1234562.5mM磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水0.80.60.40.2－－碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37℃水浴5min碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1－混匀后，37℃水浴15min(准确计时）酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶－－－－－0.110%碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37℃水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。第14页,共18页，2024年2月25日，星期天实验数据及结果管号A6501/A650[s]1/[s]123456以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。第15页,共18页，2024年2月25日，星期天实验讨论Km值的定义和意义是什么？米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？第16页,共18页，2024年2月25日，星期天现有某待测样品液5ml，将其稀释到100ml，取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量，另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入标准管，其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为：A