免疫血清的制备

免疫血清制备抗体制备技术发展的

三个阶段用纯化抗原免疫动物获得的血清多克隆抗体为第一代抗体。用B细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体为第二代抗体。第三代为基因工程抗体。上述抗体的制备方法与特点各不相同。将已知一定浓度的抗原注射免疫健康动物,经一定时间后,动物血清中可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免疫血清。多克隆抗体，回忆应答抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种途径有密切关系。实验原理抗原的两种特性：免疫原性与抗原性免疫原性的本质——异物性

与机体亲缘关系越远，组织结构的差异越大，异物性越强。影响抗原免疫应答的因素理化特性化学性质分子量大小结构的复杂性分子构象物理状态遗传、年龄、性别与健康状态免疫方法剂量、途径、次数以及免疫佐剂的选择

实验设计免疫原制备

颗粒性抗原可溶性抗原半抗原动物的选择佐剂免疫方案免疫原的制备一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化三、人工抗原的制备

一、颗粒性免疫原的制备天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或寄生虫的细胞以及细菌抗原等，制备方法相对较简单。绵羊红细胞的制备细菌免疫原的制备Back（一）绵羊红细胞的制备绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原，制备方法是采集健康绵羊的静脉血，立即注入无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内，充分摇动15～20min，以除去纤维蛋白，即得抗凝绵羊全血。免疫动物前，取适量抗凝血于离心管中，以无菌生理盐水洗涤细胞3次（每次2000rpm离心10min），然后取压积红细胞，稀释成106/ml浓度的细胞悬液，即可应用。（二）细菌免疫原的制备选用经鉴定合格的标准菌株，接种于固体或液体培养基，置温箱37℃培养24h增菌后处理。菌体抗原需要100℃水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原后应用；而鞭毛抗原要用有动力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛处理；细菌毒素抗原则应在杀菌后再加入0.5％～1％氯化钙溶液方可使用。有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。Back二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和细胞抗原的粗提（二）目的蛋白质的提纯（三）抗原与佐剂的乳化Back（一）组织和细胞抗原的粗提（1）组织匀浆的制备（2）细胞的破碎

—反复冻融法

—冷热交替法

—超声破碎法

—自溶法

—溶菌酶处理法

—表面活性剂处理法（二）目的蛋白质的提纯1．超速离心法2．选择性沉淀法3.凝胶层析法4．离子交换层析

5．亲和层析Back免疫佐剂佐剂（adjuvant）与抗原一起或预先注入机体时可有效增强免疫应答的强度或改变免疫应答的类型的非特异性免疫增强剂佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。Back佐剂的种类目前应用最多的是福氏佐剂(Freundadjuvant)。它是由液体石蜡、羊毛脂和卡介苗混合而成。福氏佐剂又可分为两种：①不完全福氏佐剂:是由液体石蜡与羊毛脂按1～5：1比例混合而成；②福氏完全佐剂:在不完全佐剂中加卡介苗(终浓度为2～20mg/ml)，即成为完全福氏佐剂。在免疫动物时，应先将福氏佐剂与抗原按1:1体积比混匀，制成“油包水”乳化液。佐剂的作用机理①改变抗原的物理性状，增加抗原在体内的潴留时间②通过刺激单核-巨噬细胞，增加对抗原的处理和提呈能力③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力Back实验方案（鼠抗BSA血清制备）动物选择：雌性昆明鼠，约20g／只。免疫剂量、途径：50ug/只，双足垫及皮内注射，再次免疫剂量减半。佐剂：弗氏佐剂，初次免疫使用完全弗氏佐剂，再次免疫使用不完全弗氏佐剂1.5mlBSA1.5ml完全福氏佐剂搅拌10-15min完全乳化抗原制备滴于水中经久不散成“油包水”乳化液电动免疫佐剂搅拌器

实验方案（鼠抗BSA血清制备）免疫佐剂制备及动物初次免疫（1d）再次免疫及血清采集（7-10d）血清采集及抗体检测（7-10d）（如效价<10-5,可进行第三次加强免疫）W1W2W3未免疫血清采集再次免疫血清采集初次免疫血清采集初次免疫再次免疫分离血清尾巴或眼眶取血，静置（或37℃30min，4℃1h）待血液凝固血块收缩析出血清，3000rpm离心15min，取上清，置冰箱保存备用抗体效价的测定根据抗原性质不同，可采取不同抗体效价测定方法。颗粒性抗原可采用凝集试验。可溶性抗原常用免疫双扩散法、间接ELISA。ELISA法检测血清抗体效价结果判定：白色背景上肉眼观察，颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据颜色深浅，以“+”“-”表示，稀释倍数最大的“+”为抗体效价。酶标仪450nm检测吸光度，>阴性对照OD值*2.1为阳性，稀释倍数最大的阳性孔其稀释倍数为该血清抗体效价。1:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:1024001:204800免疫血清的纯化由抗原免疫动物制备的免疫血清是成分复杂的混合物，除了含有特异性抗体外，还存在非特异性抗体和其他的血清成分。因此，在应用抗血清前必须先行纯化，以去除杂抗体防止血清中的其他成分干扰试验结果。IgG类抗体的纯化

1．盐析法粗提γ球蛋白

2．离子交换层析提取IgG

：DEAE3．亲和层析法抗血清的保存①4℃保存：抗血清在鉴定纯化前可保存在4℃冰箱内，为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂。4℃保存的期限为三个月或半年。②冷冻保存：是常用